金黄色葡萄球菌生物膜形成的研究进展
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［ J］ ． Nucleic Acids Research， 2007 ， 35 （ 13 ） ： e91． ［ 10］ CHARLOTTE H，MATTIAS M，JOHANNA J，et al． Dynamics of HIV － 1 quasispecies during antiviral treatment dissected using ultra － deep pyrosequencing［J］ ． PLoS ONE， 2010 ， 5 （ 7 ） ： 11345． ［ 11］ ATHE M N T，BETTE K，RAMY A，et al． Quantitative deep sequencing reveals dynamic HIV － 1 escape and large population shifts during CCR5 antagonist therapy in vivo［J］ ． PLoS ONE， 2009 ，4 （ 5 ） ： 5683．
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Heilongjiang Animal Science andVeterinaryMedicine № 6 2011
金黄色葡萄球菌生物膜形成的研究进展
1 2 陈曦伟 ， 崔玉东 ， 张 2 2 华， 曹宏伟
（ 1． 大庆市高新技术产业开发区经济科技发展局 ， 黑龙江 大庆 163319 ； 2． 黑龙江八一农垦大学， 黑龙江 大庆 163319 ） 中图分类号： S852． 61 文献标识码： A 文章编号： 1004 － 7034 （ 2011 ） 06 － 0034 － 03
细菌被包裹于胞外基质 外基质组成。生物膜形成后， 中， 对机体免疫清除作用及抗生素的杀菌作用的抵抗 力增强， 使得这两种机制均难以有效地清除感染灶 ， 且生物膜内的细菌还可不断生长并释放入血 ， 造成慢 性感染和停用抗生素后感染复发， 导致疾病迁延不 金黄色葡萄球菌生物膜形成主要经历 愈。研究表明， 2 个阶段， 即起始黏附和接下来的成熟， 它们在生理 每个阶段需要不同的特异性因子 。生 学上彼此不同， 物膜成熟后， 单细胞或细胞簇通过多种机制从生物膜 ， 中解离 金黄色葡萄球菌在机体内会形成新的感染位 点。在机体中， 金黄色葡萄球菌首先附着于基质蛋白 上。金黄色葡萄球菌可以表达多种细菌表面识别黏 使其具有结合纤维蛋白原 附基质分子（ MSCRAMM） ， 或纤维结合蛋白等基质蛋白的能力。 金黄色葡萄球 菌具有强大的体外黏附到塑料制品表面的能力 ， 这是 进行生物膜体外研究的基础。目前， 金黄色葡萄球菌 直接黏附到塑料表面在医疗装置相关感染的致病机 理中所起的作用尚不清楚。在植入的装置插入不久， 宿主的基质蛋白覆盖其表面， 因此基质蛋白和细菌表 面识别黏附基质分子之间的相互作用在细菌的定植 过程中可能发挥着更重要的作用。 金黄色葡萄球菌
关键词：金黄色葡萄球菌； 生物膜； 毒力决定因子； 感染 摘 要：生物膜形成是引起金黄色葡萄球菌感染的重要因素 。研究表明， 生物膜形成主要分为两个阶 起始的黏附和接下来的成熟。在慢性感染中， 毒力决定因子是金黄色葡萄球菌感染的关键， 已经 段， 确定许多蛋白和这一过程相关， 如多糖细胞间黏附素、 凝聚因子 A、 金黄色葡萄球菌表面蛋白、 生物膜 形成相关蛋白等。寻找新的与抗生物膜形成相关的抗感染药物和生物相容性材料 ， 将为抗金黄色葡 。 萄球菌药物和疫苗的开发提供重要的基础保证 金黄色葡萄球菌 （ S． aureus ） 是医院和社区感染 的重要病原菌之一， 也是生物膜感染常见的病原菌。 尽管由这一机会性病原菌引起疾病的严重性和类工心脏瓣膜等。 细菌在植入性医疗材料表面形 成生物膜是感染发生的重要原因。 形成生物膜的金 黄色葡萄球菌具有高度的耐药性并能逃避免疫系统 的攻击， 其感染易慢性化并难于控制。 因此， 对金黄 色葡萄球菌等临床重要病原菌的生物膜形成机制的 ［1 ］ 研究已成为抗感染领域的研究热点 。 1 生物膜的定义及形成过程 细菌生物膜（ BF） 是细菌在生长过程中为适应生 存环境的变化而附着于机体组织或生物材料表面形 成的一种与浮游细胞相对应的生长方式 ， 由细菌和胞
（ 006 ）
《黑龙江畜牧兽医》 科技版 生物膜成熟具有如下特征： ① 由多种黏附蛋白、 多糖 等胞外多聚体参与的细胞间的聚集 ； ②生物膜构造力 促进了成熟生物膜典型三维结构形成蘑菇样的细胞 塔， 细胞间的通道由液体填充。 生物膜的解离对细菌传播到其他位点的定植是 极其关键的， 这个过程最初可能是从单个细胞或大细 胞簇的解离开始。 有些因子在这个过程中发挥如下 作用： ①机械力， 如血管内流动的力； ②生物构造材料 产生的终止， 如细胞外多聚糖； ③解离因子， 如酶等破 坏了基质或表面活性剂。 在金黄色葡萄球菌中这个 ［2 ］ 过程主要由 agr 调控 。 2 生物膜形成相关基因 转录组学研究表明， 与浮游细菌生长状态相比， 金黄色葡萄球菌在生物膜生长状态下有 48 个基因诱 84 个基因受到抑制。 完整的生物膜除了多 导表达， 还包括多种成分， 如磷壁 糖细胞间黏附素 （ PIA ） 外， 酸、 凝聚因子 A （ ClfA ） 、 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G （ SasG ） 、 生 物 膜 相 关 蛋 白 （ BAP ） 及 其 他 蛋 白 和 ［3 ］ 核酸 。 2． 1 多糖细胞间黏附素 金黄色葡萄球菌生物膜形成受多因子影响 ， 其中 也称为 PNAG， 在生 最重要的是多糖细胞间黏附素， 物膜形成聚集阶段起胞间黏附的作用。 多糖细胞间 黏附素是高分子质量 β － 1 － 6 N － 乙酰葡糖胺， 合成 需要的酶由 ica 操纵子编码， 其突变可引起金黄色葡 萄球菌生物膜形成减少。 Ica 操纵子编码 4 个基因 （ icaA、 icaD、 icaB 、 icaC ） ， 转 录 为 一 个 多 顺 反 子 mRIcaD、 IcaB 、 IcaC 蛋 白。 几 乎 NA， 分 别 编 码 IcaA、 100% 的金黄色葡萄球菌临床分离株中都存在 Ica 操 纵子。Ica 操纵子的表达调控和生物膜的形成受多种 因素的影响， 如 CO2 的水平、 厌氧、 葡萄糖及渗透压 Ica 操纵 等。在金黄色葡萄球菌 ATCC35556 菌株中， 子的突变阻碍了多糖细胞间黏附素的产生 ， 出现生物 Ica 操纵子对金黄色葡萄球 膜阴性的表现型。 因此， 菌生物膜形成的作用是复杂的， 可能是菌株与环境依 赖的。多糖细胞间黏附素除了在金黄色葡萄球菌生 物膜中存在外， 在凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌生 物膜（ pga 基因） 中也存在。 2． 2 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G （ SasG ） 是细胞壁相 关蛋白， 主要在固着生长条件下表达。 SasG 表达掩 盖了指数生长期金黄色葡萄球菌细胞表达的 SPA、 凝 聚因子 B （ ClfB ） 、 纤维粘连蛋白结合蛋白 A 和 B （ FnBPA 和 FnBPB ） 与 IgG、 细胞角蛋白及纤维粘连蛋白 SasG 也掩盖了由 ClfB 、 FnBPs 介 结合的能力。 同时， 导的与纤维蛋白原的结合。 Western 免疫结果表明， 随着 SasG 诱导被掩盖黏附素的表达量并未减少 。 表 达 SasG 菌株在细胞壁上形成不同浓度的菌毛而且独
收稿日期：2010 － 11 － 04 基金项目：国家自然科学基金项目（ 310721207 ） ；黑龙江省教育 厅面上 项 目 （ 11541251 ） ； 黑 龙 江 省 科 技 厅 重 大 专 项 项 目 （ GA06B20 2 － 2 ） 作者简介：陈曦伟（ 1982 － ） ， 女， 助理工程师， 本科． cao 通信作者：曹宏伟（ 1974 － ） ， 女， 副教授， 硕士， 硕士生导师， hongwei@ hlau． cn．
2011 年 6 月（ 上） 35 立于 Ica 编码的多 糖 黏 附 素 形 成 生 物 膜。 据 推 测， SasG 菌株纤毛掩盖了细菌表面识别黏附基质分子与 ［4 ］ 配体的结合， 促进了生物膜的产生 。 2． 3 生物膜相关蛋白（ Bap） 研究表明， 生物膜相关蛋白在生物膜的形成中是 一个必要的条件， 在黏附阶段发挥胞间黏附的作用。 后来发现没有生物膜相关蛋白表达的金黄色葡萄球 菌也可以形成生物膜， 其中起重要作用的是一种含有 2 276 个氨基酸残基的蛋白质， 被称为生物膜相关蛋 在生物膜相关蛋白编码基因缺失的菌 白。研究表明， 株， 多糖细胞间黏附素合成量减少， 而在 IcaADBC 操 纵子缺失的菌株仍能生成生物膜 ， 可见生物膜的形成 并不完全依赖于多糖细胞间黏附素和 IcaADBC 操纵 子。但生物膜相关蛋白基因仅在西班牙奶牛乳腺炎 ［5 ］ 少数菌株中存在。 Vautor E 等 对 262 株金黄色葡 没有发现一个菌株携带 萄球菌临床分离株进行检测， 有该基因， 说明生物膜相关蛋白基因在金黄色葡萄球 菌中出现的概率非常低。 2． 4 葡萄球菌附属基因调节子（ Sar） 葡萄球菌附属基因调节子编码的 DNA 调节蛋白 SarA， 对毒素的合成及生物膜的形成有重要调节作 用。它在一定的条件下促进 agr 和 RNA Ⅲ 启动子的 表达， 而 sarA 的缺失可以限制 RNAⅢ产物的合成， 增 SarA 的缺 强生物膜的形成能力。 最近的研究表明， 失降低了生物膜的形成能力， 因此 sarA 可能还有一 种不依 赖 agr 的 方 式 对 生 物 膜 的 形 成 进 行 调 节。 SarA 的缺失导致了 ica 的转录抑制以及多糖细胞间 它可能是通过促进一种抑制 黏膜素的合成能力下降， SarA 是 Bap 表 性蛋白的表达对 ica 进行调节。 此外， SarA 蛋白可特异地与 bap 启动因子结 达的活化剂， ［6 ］ 合而启动其表达， 从而促进生物膜的形成 。 2． 5 凝聚因子 A（ ClfA） 凝聚因子 A 是金黄色葡萄球菌稳定生长期细胞 表面主要的纤维蛋白原结合蛋白 ， 是研究较深入的一 。 种细菌表面识别黏附基质蛋白 和大部分对数生长 期表达的表面蛋白不同， 凝聚因子 A 基因在稳定期 B 70 由 σ （ σ ） 依赖的启动子启动表达。 凝聚因子 A 在 几乎在临床所有的分离株中出现 。然 体内可以表达， ， 而 一般情况下体内细菌细胞浓度太低不能发生凝 聚， 只是细菌细胞表面覆盖了一层纤维蛋白原分子 。 凝聚因子 A 是金黄色葡萄球菌定植于植入性医疗材 ［7 ］ 料表面的主要毒力因子 。 2． 6 sarA 调节基因（ msa） sarA 调节基因为一个膜蛋白， 据推测， 其基因突 变致使 sarA 转录减少， 编码 agr 调节一些毒力因子产 agr 表达的激 生。当细菌培养进入对数生长后期时， 活是细胞浓度依赖的方式。 agr 表达诱导 RNA Ⅲ 产 使表面蛋白产生减少， 外蛋白产生增加。 此外， 生，
［ 7］ WELLEHAN J F Jr， YU F H， VENN － WATSON S K， et al． Characterization of san miguel sea lion virus populations using pyrosequencing － based methods［J］． Infect Genet Evol， 2010 ， 10 （ 2 ） ： 254 － 260． ［ 8］ RAMAKRISHNAN M A， TU Z J， SINGH S， et al． The feasibility of using high resolution genome sequencing of influenza a viruses to detect mixed infections and quasispecies［J］ ． PLoS ONE，2009 ，4 （ 9 ） ： e7105． ［ 9］ HOFFMANN C， MINKAH N，LEIPZIG J，et al． DNA bar coding and pyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations
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Heilongjiang Animal Science andVeterinaryMedicine № 6 2011
金黄色葡萄球菌生物膜形成的研究进展
1 2 陈曦伟 ， 崔玉东 ， 张 2 2 华， 曹宏伟
（ 1． 大庆市高新技术产业开发区经济科技发展局 ， 黑龙江 大庆 163319 ； 2． 黑龙江八一农垦大学， 黑龙江 大庆 163319 ） 中图分类号： S852． 61 文献标识码： A 文章编号： 1004 － 7034 （ 2011 ） 06 － 0034 － 03
细菌被包裹于胞外基质 外基质组成。生物膜形成后， 中， 对机体免疫清除作用及抗生素的杀菌作用的抵抗 力增强， 使得这两种机制均难以有效地清除感染灶 ， 且生物膜内的细菌还可不断生长并释放入血 ， 造成慢 性感染和停用抗生素后感染复发， 导致疾病迁延不 金黄色葡萄球菌生物膜形成主要经历 愈。研究表明， 2 个阶段， 即起始黏附和接下来的成熟， 它们在生理 每个阶段需要不同的特异性因子 。生 学上彼此不同， 物膜成熟后， 单细胞或细胞簇通过多种机制从生物膜 ， 中解离 金黄色葡萄球菌在机体内会形成新的感染位 点。在机体中， 金黄色葡萄球菌首先附着于基质蛋白 上。金黄色葡萄球菌可以表达多种细菌表面识别黏 使其具有结合纤维蛋白原 附基质分子（ MSCRAMM） ， 或纤维结合蛋白等基质蛋白的能力。 金黄色葡萄球 菌具有强大的体外黏附到塑料制品表面的能力 ， 这是 进行生物膜体外研究的基础。目前， 金黄色葡萄球菌 直接黏附到塑料表面在医疗装置相关感染的致病机 理中所起的作用尚不清楚。在植入的装置插入不久， 宿主的基质蛋白覆盖其表面， 因此基质蛋白和细菌表 面识别黏附基质分子之间的相互作用在细菌的定植 过程中可能发挥着更重要的作用。 金黄色葡萄球菌
关键词：金黄色葡萄球菌； 生物膜； 毒力决定因子； 感染 摘 要：生物膜形成是引起金黄色葡萄球菌感染的重要因素 。研究表明， 生物膜形成主要分为两个阶 起始的黏附和接下来的成熟。在慢性感染中， 毒力决定因子是金黄色葡萄球菌感染的关键， 已经 段， 确定许多蛋白和这一过程相关， 如多糖细胞间黏附素、 凝聚因子 A、 金黄色葡萄球菌表面蛋白、 生物膜 形成相关蛋白等。寻找新的与抗生物膜形成相关的抗感染药物和生物相容性材料 ， 将为抗金黄色葡 。 萄球菌药物和疫苗的开发提供重要的基础保证 金黄色葡萄球菌 （ S． aureus ） 是医院和社区感染 的重要病原菌之一， 也是生物膜感染常见的病原菌。 尽管由这一机会性病原菌引起疾病的严重性和类工心脏瓣膜等。 细菌在植入性医疗材料表面形 成生物膜是感染发生的重要原因。 形成生物膜的金 黄色葡萄球菌具有高度的耐药性并能逃避免疫系统 的攻击， 其感染易慢性化并难于控制。 因此， 对金黄 色葡萄球菌等临床重要病原菌的生物膜形成机制的 ［1 ］ 研究已成为抗感染领域的研究热点 。 1 生物膜的定义及形成过程 细菌生物膜（ BF） 是细菌在生长过程中为适应生 存环境的变化而附着于机体组织或生物材料表面形 成的一种与浮游细胞相对应的生长方式 ， 由细菌和胞
（ 006 ）
《黑龙江畜牧兽医》 科技版 生物膜成熟具有如下特征： ① 由多种黏附蛋白、 多糖 等胞外多聚体参与的细胞间的聚集 ； ②生物膜构造力 促进了成熟生物膜典型三维结构形成蘑菇样的细胞 塔， 细胞间的通道由液体填充。 生物膜的解离对细菌传播到其他位点的定植是 极其关键的， 这个过程最初可能是从单个细胞或大细 胞簇的解离开始。 有些因子在这个过程中发挥如下 作用： ①机械力， 如血管内流动的力； ②生物构造材料 产生的终止， 如细胞外多聚糖； ③解离因子， 如酶等破 坏了基质或表面活性剂。 在金黄色葡萄球菌中这个 ［2 ］ 过程主要由 agr 调控 。 2 生物膜形成相关基因 转录组学研究表明， 与浮游细菌生长状态相比， 金黄色葡萄球菌在生物膜生长状态下有 48 个基因诱 84 个基因受到抑制。 完整的生物膜除了多 导表达， 还包括多种成分， 如磷壁 糖细胞间黏附素 （ PIA ） 外， 酸、 凝聚因子 A （ ClfA ） 、 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G （ SasG ） 、 生 物 膜 相 关 蛋 白 （ BAP ） 及 其 他 蛋 白 和 ［3 ］ 核酸 。 2． 1 多糖细胞间黏附素 金黄色葡萄球菌生物膜形成受多因子影响 ， 其中 也称为 PNAG， 在生 最重要的是多糖细胞间黏附素， 物膜形成聚集阶段起胞间黏附的作用。 多糖细胞间 黏附素是高分子质量 β － 1 － 6 N － 乙酰葡糖胺， 合成 需要的酶由 ica 操纵子编码， 其突变可引起金黄色葡 萄球菌生物膜形成减少。 Ica 操纵子编码 4 个基因 （ icaA、 icaD、 icaB 、 icaC ） ， 转 录 为 一 个 多 顺 反 子 mRIcaD、 IcaB 、 IcaC 蛋 白。 几 乎 NA， 分 别 编 码 IcaA、 100% 的金黄色葡萄球菌临床分离株中都存在 Ica 操 纵子。Ica 操纵子的表达调控和生物膜的形成受多种 因素的影响， 如 CO2 的水平、 厌氧、 葡萄糖及渗透压 Ica 操纵 等。在金黄色葡萄球菌 ATCC35556 菌株中， 子的突变阻碍了多糖细胞间黏附素的产生 ， 出现生物 Ica 操纵子对金黄色葡萄球 膜阴性的表现型。 因此， 菌生物膜形成的作用是复杂的， 可能是菌株与环境依 赖的。多糖细胞间黏附素除了在金黄色葡萄球菌生 物膜中存在外， 在凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌生 物膜（ pga 基因） 中也存在。 2． 2 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G 金黄色葡萄球菌表面蛋白 G （ SasG ） 是细胞壁相 关蛋白， 主要在固着生长条件下表达。 SasG 表达掩 盖了指数生长期金黄色葡萄球菌细胞表达的 SPA、 凝 聚因子 B （ ClfB ） 、 纤维粘连蛋白结合蛋白 A 和 B （ FnBPA 和 FnBPB ） 与 IgG、 细胞角蛋白及纤维粘连蛋白 SasG 也掩盖了由 ClfB 、 FnBPs 介 结合的能力。 同时， 导的与纤维蛋白原的结合。 Western 免疫结果表明， 随着 SasG 诱导被掩盖黏附素的表达量并未减少 。 表 达 SasG 菌株在细胞壁上形成不同浓度的菌毛而且独
收稿日期：2010 － 11 － 04 基金项目：国家自然科学基金项目（ 310721207 ） ；黑龙江省教育 厅面上 项 目 （ 11541251 ） ； 黑 龙 江 省 科 技 厅 重 大 专 项 项 目 （ GA06B20 2 － 2 ） 作者简介：陈曦伟（ 1982 － ） ， 女， 助理工程师， 本科． cao 通信作者：曹宏伟（ 1974 － ） ， 女， 副教授， 硕士， 硕士生导师， hongwei@ hlau． cn．
2011 年 6 月（ 上） 35 立于 Ica 编码的多 糖 黏 附 素 形 成 生 物 膜。 据 推 测， SasG 菌株纤毛掩盖了细菌表面识别黏附基质分子与 ［4 ］ 配体的结合， 促进了生物膜的产生 。 2． 3 生物膜相关蛋白（ Bap） 研究表明， 生物膜相关蛋白在生物膜的形成中是 一个必要的条件， 在黏附阶段发挥胞间黏附的作用。 后来发现没有生物膜相关蛋白表达的金黄色葡萄球 菌也可以形成生物膜， 其中起重要作用的是一种含有 2 276 个氨基酸残基的蛋白质， 被称为生物膜相关蛋 在生物膜相关蛋白编码基因缺失的菌 白。研究表明， 株， 多糖细胞间黏附素合成量减少， 而在 IcaADBC 操 纵子缺失的菌株仍能生成生物膜 ， 可见生物膜的形成 并不完全依赖于多糖细胞间黏附素和 IcaADBC 操纵 子。但生物膜相关蛋白基因仅在西班牙奶牛乳腺炎 ［5 ］ 少数菌株中存在。 Vautor E 等 对 262 株金黄色葡 没有发现一个菌株携带 萄球菌临床分离株进行检测， 有该基因， 说明生物膜相关蛋白基因在金黄色葡萄球 菌中出现的概率非常低。 2． 4 葡萄球菌附属基因调节子（ Sar） 葡萄球菌附属基因调节子编码的 DNA 调节蛋白 SarA， 对毒素的合成及生物膜的形成有重要调节作 用。它在一定的条件下促进 agr 和 RNA Ⅲ 启动子的 表达， 而 sarA 的缺失可以限制 RNAⅢ产物的合成， 增 SarA 的缺 强生物膜的形成能力。 最近的研究表明， 失降低了生物膜的形成能力， 因此 sarA 可能还有一 种不依 赖 agr 的 方 式 对 生 物 膜 的 形 成 进 行 调 节。 SarA 的缺失导致了 ica 的转录抑制以及多糖细胞间 它可能是通过促进一种抑制 黏膜素的合成能力下降， SarA 是 Bap 表 性蛋白的表达对 ica 进行调节。 此外， SarA 蛋白可特异地与 bap 启动因子结 达的活化剂， ［6 ］ 合而启动其表达， 从而促进生物膜的形成 。 2． 5 凝聚因子 A（ ClfA） 凝聚因子 A 是金黄色葡萄球菌稳定生长期细胞 表面主要的纤维蛋白原结合蛋白 ， 是研究较深入的一 。 种细菌表面识别黏附基质蛋白 和大部分对数生长 期表达的表面蛋白不同， 凝聚因子 A 基因在稳定期 B 70 由 σ （ σ ） 依赖的启动子启动表达。 凝聚因子 A 在 几乎在临床所有的分离株中出现 。然 体内可以表达， ， 而 一般情况下体内细菌细胞浓度太低不能发生凝 聚， 只是细菌细胞表面覆盖了一层纤维蛋白原分子 。 凝聚因子 A 是金黄色葡萄球菌定植于植入性医疗材 ［7 ］ 料表面的主要毒力因子 。 2． 6 sarA 调节基因（ msa） sarA 调节基因为一个膜蛋白， 据推测， 其基因突 变致使 sarA 转录减少， 编码 agr 调节一些毒力因子产 agr 表达的激 生。当细菌培养进入对数生长后期时， 活是细胞浓度依赖的方式。 agr 表达诱导 RNA Ⅲ 产 使表面蛋白产生减少， 外蛋白产生增加。 此外， 生，
［ 7］ WELLEHAN J F Jr， YU F H， VENN － WATSON S K， et al． Characterization of san miguel sea lion virus populations using pyrosequencing － based methods［J］． Infect Genet Evol， 2010 ， 10 （ 2 ） ： 254 － 260． ［ 8］ RAMAKRISHNAN M A， TU Z J， SINGH S， et al． The feasibility of using high resolution genome sequencing of influenza a viruses to detect mixed infections and quasispecies［J］ ． PLoS ONE，2009 ，4 （ 9 ） ： e7105． ［ 9］ HOFFMANN C， MINKAH N，LEIPZIG J，et al． DNA bar coding and pyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations