抗血清的制备

抗血清的制备

原理：

抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。高效价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。一般完全抗原免疫动物需加用佐剂，使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。

材料：

1、苦味酸染料；

2、1毫升注射器；

3、EP管、刀片；

4、福氏完全佐剂（Freund ’s complete adjuvant）；福氏不完全佐剂（Freund’s discomplete adjuvant）

5、抗原（本课题组所用抗原为重组蛋白Eg-TPX(his)/rGST(his)/EPC1(his)）；

6、无菌PBS，消毒用酒精、无菌棉球；

7、实验动物（昆明白小鼠）。

步骤

1、动物的选择

课题组选用18g-20g昆明白小鼠进行免疫。

2、抗原制备

1）抗原剂量:首次抗原剂量为20～25μg/次，与等量的福氏完全佐剂混合，抗原乳剂200ul。加强免疫抗原与不完全福氏佐剂混合，剂量为首次计量的1/2。

2）抗原乳剂的配制

将等量的佐剂和抗原溶液倒入容积内，经过蛋白搅拌器反复碾磨，可形成油包水乳剂。制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整基本不分散，不合格的则立即扩散，水面油亦逐渐扩大，须继续操作至质量合格为止。检查合格后，离心，2500r,5min.

3、免疫途径，剂量和免疫周期

免疫方案为抗原皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原作多次加强免疫，一般间隔2周，皮下或腹腔注射加强免疫。具体时间如下表所示：

免疫时间免疫次数免疫途径抗原免疫剂量第一周第一次背部皮下多点注射重组蛋白+福氏完全佐剂20~25ug 第三周第二次腹部皮下多点注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第五周第三次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第七周第四次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第九周第五次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug ……腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第N周第N次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug

4、试血测定抗体效价

一般在第三次免疫后3天即可小鼠尾尖取少量血，分离血清后通过间接法测定抗体

效价。若抗体效价较高，即可获取静脉血。若抗体效价反应不明显，则需加强免疫

一次，再进行从测定。本课题组对昆明白小鼠采取割尾静脉法获得抗血清。每次加

强免疫，采血4-6次后，需进行效价检测，若血清中的抗体效价下降明显，需进行

加强免疫。

5、分离血清，做好标记，冻存于-200C.

注意事项

1、动物的免疫反应存在着个体差异，制备抗血清时不能只免疫一只动物，一般最好免疫3～4只，因为有的动物可能产生抗体效价很低或不产生抗体，免疫反应好的动物所能提供的抗体往往高于一般动物3～4倍。

2、制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，如不是油包水乳剂，应重新制备。

3、要制备高效价的抗体，必须要加佐剂（一般采用完全福氏佐剂），加佐剂后免疫动物，抗体效价至少可增加5倍。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。

4、分装保存的抗血清应注明抗血清的名称，制备日期。

5、抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。