动物细胞培养用生物反应器及相关技术

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中 国 生 物 工 程 杂 志
第 23 卷
新型灌注方法 ,它是利用沉淀罐把抽出的培养物首 先进行沉淀 ,再将培养液和细胞进行分离 ,在培养 细胞重新回到培养罐的同时 ,更换新鲜培养液 ,使 细胞处于旺盛生长状态 。在气升式生物反应器中 , 利用该技术可使生产单克隆抗体的杂交瘤细胞达 到 1131 ×107 cellsΠml 的高密度 。 312 增加细胞生长表面积
是开发较早和正在不断改进的一类生物反应 器 ,它的特点是细胞培养环境温和 ,培养细胞密度 较高 (107 ～108 cellsΠml) ,产品较容易分离纯化[12] 。 但是 ,这种生物反应器的培养环境不够均一 ,这在 一定程度上影响了产品质量稳定 。而且 ,中空纤维 培养工艺不容易放大 ,反应器本身的消毒和重复使 用也相对困难[13] 。
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第 11 期
王佃亮 :动物细胞培养用生物反应器及相关技术
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(NH3 ) 、NH4+ 等参数 。 这种生物反应器培养规模可达 2000L ,如果再
中空纤维生物反应器 (hollow fiber bioreactor) 一 般用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 ,也有人将 其改造为一种治疗装置 ,但其他具有经济价值的动 物细胞或基因工程细胞的培养未见报道 。 214 空间生物反应器
20 世纪 90 年代中期 ,NASA 开发了一系列旋 转式 细 胞 培 养 系 统 ( the rotary cell culture syetem , RCCS) , 又 叫 回 转 生 物 反 应 器 ( rotating wall vessel bioreactor ,RWVB) ,其培养容器主要由内外两个圆 筒组成 ,外筒固定 ,内筒可旋转以悬浮培养物[14] 。
摘要 动物细胞大量培养是生产生物制品的重要途径 ,它用到的关键设备是生物反应器 。根据 培养细胞 、培养载体 、培养液混合方式的不同 ,生物反应器主要有搅拌式 、气升式 、中空纤维式 、回 转式等 ,其中搅拌式规模最大 。回转式是 NASA 于 20 世纪 90 年代中期开发的一种新型生物反应 器 ,被誉为空间生物反应器 ,可用于组织工程研究 。与生物反应器配套的技术主要有灌注 、微载 体 、多孔微球 、转入抗凋亡基因等 ,可以有效地提高细胞密度 ,增加生物制品产量 ,提高质量 。今 后生物反应器研制主要朝两个方向发展 :一是 ,以高密度培养动物细胞生产蛋白质药物为目的 , 二是以三维培养动物细胞 (主要是人类细胞) 再生组织或器官为目的 。 关键词 生物反应器 动物细胞培养 组织工程
此外 ,法国 、瑞士的科学家也各自研制了空间 细胞培养装置 , 模拟微重力环境 , 培养三维细 胞 。 [18 ,19 ] 215 其他生物反应器
近年来在细胞与组织工程领域用到的还有搅 拌瓶生物反应器 (spinner bottle bioreactor) 、流化床生 物反应器 (fluidized bioreactor ) 、Petri 碟生物反应器 ( Petri bioreactor ) 、脉 动 式 生 物 反 应 器 ( pulsatile bioreactor) 、摇床式生物反应器 ( shaking bioreactor) 、 填充床生物反应器 (packed bed bioreactor) 等[2 ,3 ,5 ,20] , 由于这些生物反应器应用不普遍 ,故不详述 。
有些动物细胞需要贴附在支持物表面生长 ,如 果能够增加生物反应器内支持物的表面积 ,细胞密 度必然会相应增加 。
微载体就是这样一种细胞生长支持物 ,其最佳 直径范围为 100～300μm ,制作材料有纤维素 、葡聚 糖 、明胶 、胶原 、玻璃 、聚苯乙烯等 。由于它有效地 增加了细胞生长表面积 ,培养细胞密度甚至可以达 到 106 ～107 cellsΠml 的数量级 。主要加入新的微载 体 ,旧微载体上的细胞能够自动转移过去生长 ,这 对于培养工艺放大特别有利[21] 。
罐注培养的优势是可以长期高密度培养动物 细胞 ,这对于以获取细胞分泌物为目的的细胞培养 来说特别有利 。由于分泌物就在不断抽走的培养 液里 ,通过分离纯化 ,就能源源不断地获得细胞产 品 ,尤其适于工厂化生产 ,而且 ,罐注培养也有助于 减少培养细胞污染的机会 。Wen 等[11 ] 报道了一种
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由于可模拟空间中的微重力环境 ,该生物反应 器被誉为空间生物反应器 。其模拟空间环境的机 理是 ,它可使培养物的重力向量在旋转过程中产生
随机化 ,导致一定程度的重力降低 ,使细胞处于一 种模拟自由落体状态 ,以此模拟微重力环境[15] 。
回转生物反应器由于没有搅拌剪切力影响 ,细 胞可以在相对温和的环境中进行三维生长 ,同时随 机化的重力向量可能直接影响细胞的基因表达 ,或 者间接促进细胞的自分泌Π旁分泌 ,从而影响细胞 的增殖分化和组织器官形成 ,因而这种生物反应器 可用于当前十分热门的组织工程研究 ,也可用于探 索微重力环境对细胞生长 、分化的影响[16 ,17] 。
多孔微球是一种新型微载体 ,培养细胞既可以 在它的表面生长 ,也可以在它的内部生长 ,这样极 大地提高了细胞生长表面积 ,培养细胞密度可以达 到 107 ～108 cellsΠml ,而且 ,多孔网络有利于培养细 胞立体生长 ,稳定地分泌细胞产品[22～24] 。
多孔微球的制作材料和普通微载体类似 ,但制 作工艺相当复杂 ,难度要求很高 。值得一提的是 , 并不是所有的材料都适合培养细胞 ,实际上有些材 料对细胞是有毒的 。即使是那些对细胞没有毒性 的材料 ,也不见得是细胞培养的最好材料 。因而 , 用于细胞培养的材料需要针对具体的细胞和培养 环境进行选择 。 313 抑制细胞凋亡
配合微载体 、多孔微球 、罐注技术 ,可使培养细胞达 到 107 cellsΠml 以上的密度 ,而且消毒方便 。对于几 升的玻璃罐 ,可以用高压锅灭菌 ;对于几十升及以 上的不锈钢罐 ,可以利用反应器本身附带的灭菌装 置就地加热灭菌 。
搅拌式生物反应器的最大优点是 ,能培养各种 类型的动物细胞 ,培养工艺容易放大 ,产品质量稳 定 ,非常适合于工厂化生产 ,在生物制品开发中潜 力很大 。但这种生物反应器也有美中不足之处 ,即 机械搅拌会产生一定剪切力 ,对细胞造成某种程度 上的损伤 ,不过在具体操作中可通过改变搅拌桨叶 形状 、在培养基中添加保护剂等措施来解决[10] 。 212 气升式
生物反应器自动化程度越高 ,相应配备的传感 器数量也越多 。在整个培养过程中 ,依靠各种不同 的传感器 ,生物反应器能够在线 (on line) 连续监测 和调整与细胞生长 、分化 、增殖 、凋亡有关的参数 , 使它们始终保持最佳组合 。这样才能有效地进行 物质传递 ,使培养细胞生长均匀 、产品质量稳定[9] 。
第 23 卷第 11 期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2003 年 11 月
动物细胞培养用生物反应器及相关技术
王佃亮1 3 韩梅胜2
(1 北京航空航天大学生物工程系 北京ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 100083 2 北京市中奥维科技发展有限公司 北京 100083)
3 生物反应器相关技术
生物反应器是动物细胞培养的基本装置 ,但是 要想提高细胞的生产效率 ,还需要其他一些技术 。 311 灌注培养
罐注培养是相对于批式培养而言的 。所谓批 式培养是指 ,一次加足培养细胞 、培养载体 、培养液 后 ,培养一定时间 ,然后一次性收获细胞及细胞产 品 。这种培养方法很难达到很高的细胞密度 。罐 注培养则是通过在生物反应器上添加一个动力装 置 ,不断地向培养物中加入新鲜培养液 ,同时不断 地抽走相同量的旧培养液 ,培养细胞可以达到很高 的密度[21] 。这是因为 :一 ,旧培养液里含有细胞代 谢产生的废物 (如 NH3 ) ,这些物质对细胞是有毒 的 ,会抑制其生长 ;二 ,新鲜培养液里含有细胞生长 需要的丰富营养物质 ,培养细胞能够旺盛生长 。
2 主要生物反应器及性能
目前国内外生物反应器种类较多 ,应用于生产 实际的也不少 ,概括下来主要有以下几种 : 211 机械搅拌式
是开发较早也是在研究 、中试和生产中应用广 泛的一类生物反应器 ,主要由培养罐 、管 、阀 、泵 、马 达及仪器组成[1] 。实验室里用的一般是小型耐热 硼酸盐玻璃罐体 ,大型生物反应器罐体是不锈钢制 造的 。培养物的混匀由电动马达带动的不锈钢搅 拌系统实现 ,在罐体顶端还有一些传感器 ,可以连 续监 测 培 养 物 的 温 度 、pH、DO 、葡 萄 糖 消 耗 、氨
当然 ,生物反应器的概念很广 ,转基因动物 (及 转基因植物) 本身就是优秀的天然生物反应器 ,由 于这种活体生物反应器具有生产效率高 、成本低廉 的优势 ,因而这一领域也发展很快[ 7 ,8] ,但本文主 要讨论动物细胞体外培养用生物反应器 。
1 动物细胞生物反应器设计的限制因素
与微生物 、植物细胞不同 ,动物细胞没有细胞 壁 ,在人工培养环境中易受损伤 ,这在客观上增加 了动物细胞生物反应器设计的难度 。
近年来发现 ,生物反应器内培养的动物细胞也 存在凋亡现象 。由于氧气缺乏 、营养物质供给不 足 、代谢废物积累 、剪切力 、细胞密度 、微生物污染 等原因 ,培养的细胞会发生由自身基因控制的程序 化自杀现象 ,也就是细胞凋亡 。这种死亡与细胞受 到机械损伤造成的死亡截然不同[25] 。
培养细胞的自发凋亡 ,一方面会使细胞产品的 产量下降 ,另一方面死亡细胞释放的蛋白酶可降解 细胞分泌的目的产物 。如何有效地抑制细胞凋亡 , 是细胞工程的一个重大课题 。国外 ,有人向培养细 胞中加入 bcl22 、bcl2xl 、p21 、p27 基因 ,可以有效地抑制 培养细胞由于环境压力造成的自发凋亡 ,改善了产
作为一个理想的动物细胞生物反应器 ,应该能 够很好地满足动物细胞高密度增殖的需要 ,同时也 要保证动物细胞高效分泌目标产品 。动物细胞的
收稿日期 :2003206218 修回日期 :2003208201 3 电子信箱 :wangdinal @sina. com
高密度增殖取决于诸多因素 ,包括适宜的 pH、温 度 、溶氧 (dissolved oxygen ,DO) 、营养物质消耗 (包括 葡萄糖 、氨基酸 、必需脂肪酸等的消耗情况) 、代谢 废物积累 (包括乳酸 、氨等的产生情况) 、搅拌速率 (或氧气 、营养物质和代谢废物传递效率) 、细胞生 长空间以及抗凋亡因素等 。因而 ,在生物反应器设 计时 ,需要综合考虑这些参数 ,并兼顾到培养规模 放大时简单易行 。
这种生物反应器在结构上和搅拌式大同小异 , 它的显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌 , 因而产生的剪切力相对温和 ,对细胞损伤小 。不过 也有的生物反应器使用液流或气液流进行搅拌 ,但 设计原理是一样的 。这种生物反应器的特点是通 气和搅拌一次性完成 ,培养环境比较温和[11] 。 213 中空纤维
动物细胞培养在当今生物制品生产中已越来 越重要 ,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反 应器[1～3] 。当今 ,各国科学家根据科研和生产需要 设计了形形色色的生物反应器 ,用于高密度培养动 物 、植物和微生物细胞 ,然而由于动物细胞 (尤其是 哺乳动物细胞) 在促红细胞生成素 ( EPO ,治疗恶性 贫血) 、干扰素 ( IFN ,治疗病毒病和肿瘤) 、尿激酶原 (Pro2UK ,治疗血栓) 、疫苗以及其他一些价值昂贵 的生物制品生产方面具有独特的优势 ,针对动物细 胞的生物反应器研制近年来进展迅速[4～6] 。