固定化酶与固定化细胞优秀课件
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固定化酶和细胞原理 ppt课件
的酶活力单位。
•
或：单位面积（cm2）的酶活力单位
表示（酶膜、酶管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶
活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第八章 固定化酶反应原理与 技术
概述
• 酶催化剂的优点：
• 专一性强，
• 反应条件温和，
•
反应速度较快。
• 弱点：
• 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；
• 溶液酶稳定性差，易失活。
1969出现了固定化酶技术。 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制 或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。
（三）交联法的形式
• 交联法有2种形式：
•
• 双重固定法
（1） 吸附交联法 • （2） 交联包埋法
酶直接交联法 酶辅助蛋白交联
酶直接交联法
• 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成 不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓 度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间 之间的平衡。
酶辅助蛋白交联
• 为避免分子内交联和在交联过程中因化学 修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体" 蛋白质.
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
•
或：单位面积（cm2）的酶活力单位
表示（酶膜、酶管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶
活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第八章 固定化酶反应原理与 技术
概述
• 酶催化剂的优点：
• 专一性强，
• 反应条件温和，
•
反应速度较快。
• 弱点：
• 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；
• 溶液酶稳定性差，易失活。
1969出现了固定化酶技术。 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制 或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。
（三）交联法的形式
• 交联法有2种形式：
•
• 双重固定法
（1） 吸附交联法 • （2） 交联包埋法
酶直接交联法 酶辅助蛋白交联
酶直接交联法
• 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成 不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓 度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间 之间的平衡。
酶辅助蛋白交联
• 为避免分子内交联和在交联过程中因化学 修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体" 蛋白质.
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
固定化酶和固定化细胞ppt课件
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❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
18
载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
19
❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
14
❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
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载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
19
❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
14
❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
《酶的固定化》PPT课件
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )
固定化酶与固定化细胞 ppt课件
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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17
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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18
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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23
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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12
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
固定化酶与固定化细胞课件
作用。
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理 离子交 吸附法 换吸附
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微 孔膜内 。
半透膜：直径几十微米到几百微米， 厚约25nm。
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶 的空间构象而影响酶的催化活性。
四 原生质体的固定化方法
一、固定化酶和细胞的定义及特点
1.固定化酶(immobilized enzyme) 通过化学或物理的手段将酶定位于限
定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶固定化方法要求
①不破坏酶活性中心的构象：酶的固定化不能破坏 酶活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸 残基受到影响；
纤维素
优点：条件温和，操作简 便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解吸 附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理 离子交 吸附法 换吸附
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微 孔膜内 。
半透膜：直径几十微米到几百微米， 厚约25nm。
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶 的空间构象而影响酶的催化活性。
四 原生质体的固定化方法
一、固定化酶和细胞的定义及特点
1.固定化酶(immobilized enzyme) 通过化学或物理的手段将酶定位于限
定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶固定化方法要求
①不破坏酶活性中心的构象：酶的固定化不能破坏 酶活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸 残基受到影响；
纤维素
优点：条件温和，操作简 便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解吸 附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
酶、细胞、原生质体的固定化ppt课件
己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸酯、
双重氮联苯胺等。
包埋法
包埋法是将酶包埋在多聚物内的一种方法。 分为：
凝胶包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微 网格中，常用的载体有明胶、琼脂、琼脂糖、 聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠等；
微胶囊法：将酶包埋在直径只需几微米至 几百微米的高分子半透膜中，方法有界面沉淀 法、界面聚合法、二级乳化法以及脂质体包埋 法。
加。 缘由： 酶蛋白分子的高级构造发生变化 载体的静电相互作用
固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 〔1〕有活性升高的景象。 〔2〕稳定性的添加 。 〔3〕最适温度和最适pH常坚持不变。
固定化酶的评价目的
酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，普通用于测定自然酶活
力的方法改良后才干用于测定固定化酶。 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 半衰期 在延续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为
酶、细胞、原生质体的固定化
徐彤砚 孟莉
主要内容
酶的固定化 细胞的固定化 原生质体的固定化 固定化酶与固定化细胞的性质与表征
酶的固定化
作为一种生物催化剂，酶具有专注 性强、催 化效率高、反响条件温暖等优点，在食品工业 中发扬着重要的作用。
然而，酶的稳定性差，在强酸、强碱、热及有 机溶剂等作用下容易变性，从而使酶活性降低， 甚至失活；
吸附-包埋
包埋法具有操作方便、条件温暖、根本不会改动酶的构造、酶不 易零落等优势、但也存在机械强度差、酶易走漏、传质阻力较大 等问题。利用耦合固定化技术可以很好地处理上述问题。
包埋法运用的一些凝胶分子的间隙较大，容易呵斥酶在其中的疏 漏，通常可以运用以下方法处理:①用交联或共价结合的方法处 置包埋酶颗粒；②将酶吸附在一些大分子颗粒上来增大酶分子的 体积。将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再利用 海藻糖包埋，处理了单一吸附呵斥的酶走漏问题，同时包埋-吸 附法改善了包埋法传质阻力大的缺陷，吸附剂的参与降低了固定 化细胞的疏漏，添加细胞在载体中的分散性 。研讨阐明将吸附 剂添加到卡拉胶包埋体系中，与单一的吸附相比固定化细胞转化 L-苯丙氨酸转化才干提高了52%，处理了转化才干差的问题
第二章 4 固定化酶与固定化细胞PPT课件
22
D．溴化氰法
23
（三）交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法称为 交联法。往往与其他方法连用
24
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
25
（四） 包埋法
包埋法分为网格型和微囊型 1．网格型 2．微囊型
13
（二）结合法
1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
14
1 离子键结合法
常用载体:纤维素， 葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度
15
2 共价键结合法
（ 1 ）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
（ 2 ）常用载体：天然高分子、人工合成 的高聚物、无机载体
26
1．网格型
(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微 网格中，制成一定形状的固定化酶，称为 网格型包埋法。也称为凝胶包埋法
27
2．微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
28
29
30
43
三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，
参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不
能自行再生 有机辅因子价格昂贵
44
辅酶固定化的方法：
2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化 氰法以及重氮偶联法等共价偶联。
3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之 间传递的障碍。
固定化酶与固定化细胞
D．溴化氰法
23
（三）交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法称为 交联法。往往与其他方法连用
24
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
25
（四） 包埋法
包埋法分为网格型和微囊型 1．网格型 2．微囊型
13
（二）结合法
1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
14
1 离子键结合法
常用载体:纤维素， 葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度
15
2 共价键结合法
（ 1 ）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
（ 2 ）常用载体：天然高分子、人工合成 的高聚物、无机载体
26
1．网格型
(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微 网格中，制成一定形状的固定化酶，称为 网格型包埋法。也称为凝胶包埋法
27
2．微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，
参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不
能自行再生 有机辅因子价格昂贵
44
辅酶固定化的方法：
2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化 氰法以及重氮偶联法等共价偶联。
3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之 间传递的障碍。
固定化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶也存在一些缺点：
(1) 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本， 使工厂开始投资大 (2) 比较适应水溶性底物和小分子底物 (3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。 同时，对胞内酶需经分离后才能固定化
固定化酶
酶的固定化方法
吸附法；共价结合法；交联法；包埋法
固定化酶
吸附法
吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法
(1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，
将酶固定于水不溶载体上，制成固定化酶
①有机载体，纤维素、骨胶原、淀粉等
如，用纤维素作为吸附剂吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱 氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70 mg/cm2
固定化酶
交联方法：
(1) 交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液 中，生成不溶性固定化酶
如：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊二醛、pH 5.2-7.2、0℃ 下 交联24h，可形成固定化酶
这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定 酶活力
如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L 醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5 ％戊二醛，在室温下放置10-30min，会有沉淀析出，1-3h内反应结束。 形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶
其优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失 活，同时，制作手续亦较繁琐
(1)酶分子和载体连接的功能基团
(2)
从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：
① 酶蛋白N-端的氨基或赖氨酸残基氨基
② 酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基和Glu残基的羧基
③ Cys残基的巯基
④ Ser、Tyr、Thr残基的羟基 ⑤ Phe和Tyr残基的苯环 ⑥ His残基的咪唑基 ⑦ Trp残基的吲哚基
固定化酶
(2) 载体交联法 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功
能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法
单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，常将此 法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的 活力，又起到加固的效果
固定化酶
共价结合法
酶蛋白侧链基团和载体表面功能基团之间形成共价键 而固定的方法
固定化酶与固定化细胞优秀课 件
固定化酶
固定化酶(Immobilized Enzyme）
➢ 20世纪60年代发展起来的一项新技术 ➢ 以往使用的酶绝大多数是水溶性酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回 收，因而阻碍了酶工业的进一步发展 ➢ 60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。通过物理的或化学的手 段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分 子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用 ➢ 曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采 用固定化酶的名称 ➢ 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的 固定化方法研究上，近来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并 且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以 及理论研究等方面的应用研究
但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化 酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化 酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性
固定化酶
交联法
利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进行 交联反应，以制备固定化酶的方法
最常用的交联试剂是戊二醛，用戊中偶联最普遍的基团是：氨基、羧 基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性 的非必需基团，否则将导致酶失去活性
固定化酶
(2) 载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度 ③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团 ④载体没有或很少有非专一性吸附 ⑤载体来源容易，并能反复使用
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧 (±1-2pH单位)吸附将明显减少 ➢ 盐可以促进蛋白质的吸附，即所谓盐析吸附 ➢ 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降 ➢ 载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附
固定化酶
吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同 形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失 活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用
②无机载体，氧化铅、高岭土、多孔硅、多孔玻璃等
如，用多孔硅为载体吸附淀粉酶，在45℃进行固定化，用高浓度底物 进行连续反应。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落
固定化酶
(2)离子交换吸附法: 将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结
合而达到固定化的一种方法
酶吸附较牢，在工业上具广泛用途
常用载体： ①阴离子交换剂，二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA） -纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶 ②阳离子交换剂，羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐
固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留， 简化了提纯工艺 (2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性 (5) 较能适应于多酶反应 (6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
固定化酶
通过酶蛋白化学修饰增加蛋白质分子上电荷，能有效的 克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶， 可以用DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质 浓度及酶和载体的特性相关
(3) 偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而 且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定 作用，必须考虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试 剂的成本等因素