不同细胞裂解液提取总蛋白在免疫印迹中的效果分析

不同细胞裂解液提取总蛋白

在免疫印迹中的效果分析*

王丽，张永亮，何涛，李娟，刘晓燕

（泸州医学院医学分子生物学实验室，四川泸州646000）

摘要目的：寻找一种适合乳腺癌细胞MCF-7蛋白提取的裂解液配方用于免疫印迹分析。方法：配制两种不同的细胞裂解液A与B，分别对培养的密度相当的人乳腺癌细胞MCF-7进行总蛋白的提取，Bradford法测蛋白含量，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离，免疫印迹法检测β-actin和Twist的表达，比较2种裂解液裂解效果。结果：2种细胞裂解液均可满足免疫印迹分析的要求，B液提取的蛋白含量虽比A液高，但A液用于免疫印迹检测β-actin和Twist的效果更佳。结论：免疫印迹分析结果显示：A细胞裂解液（50mM pH7.4Tris-HCl，150mM NaCl，0.1%SDS，1%NP-40，1mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM）可作为提取乳腺癌细胞MCF-7中蛋白的一种理想配方。

关键词细胞裂解液；蛋白提取；免疫印迹；MCF-7

中图分类号Q533文献标识码A文章编号1000-2669（2010）4-0367-03

THE EFFECT ANALYSIS OF DIFFERENT CELL LYSATE ON TOTAL PROTEIN EXTRACTION IN WESTERN BLOT

Wang Li,et al

Laboratory of Medical Molecular Biology,Luzhou Medical College

Abstract Objective：To search a suitable cell lysate for extraction of proteins from human breast cancer cells MCF-7for Western blot．Methods:The proteins were extracted from human breast cancer cells by two different cell lysates:A and B.Then total proteins were collected and quantified with the method of bradford.The proteins were separated by SDS-PAGE,and the protein of beta-actin and Twist were assessed by Western blot. Results:The beta-actin and twist of all samples can be observed by Western blot.Though the concentration of proteins extracted by cell lysate A were lower than by cell lysate B,the effect of cell lysate A was better than that of cell lysate B used in Western blot.Conclusion:The cell lysate A is more suitable for extracting proteins from human breast cancer cells MCF-7．

Key words Cell lysate;Western blot；Protein extraction;MCF-7

免疫印迹技术是将凝胶电泳与固相免疫结合，对多种病毒抗体或抗原进行检测的一项分子生物学技术。蛋白样品制备是此项技术运用中的一个关键环节，样品处理合适与否，获得的蛋白含量高低以及质量优劣将直接影响分析结果的可靠性。目前提取蛋白所用的裂解液种类繁多，效果差异性较大。本研究运用两种不同类型细胞裂解液对体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7进行裂解，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白进行分离，利用免疫印迹法对乳腺癌细胞中的β-actin和小分子蛋白Twist的表达情况进行检测，从而确定一种裂解效果好，能满足免疫印迹对小分子、低含量蛋白进行有效检测的裂解液配方，为以免疫印迹为蛋白检测平台的相关研究提供一定参考。

1材料与方法

1.1材料

*基金项目：四川省教育厅科研项目（NO.08ZA091）作者简介：王丽（1976－），女，讲师，硕士

通讯作者,何涛（1968－），女，教授，硕士论著

泸州医学院学报2010年第33卷第4期

Journal of Luzhou Medical College Vol.33No.42010367

泸州医学院学报2010年第33卷第4期Journal of Luzhou Medical College Vol.33No.42010

人乳腺癌细胞株MCF-7(本实验室保存)；新生小牛血清、RPMI－1640培养基（Gibco公司）；β-actin 兔抗人多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；Twist兔抗人多克隆抗体（美国Baylor College of Medicine的徐建明博士馈赠）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（中杉金桥公司）；彩色预染蛋白质分子量标准（碧云天生物技术研究所）；Pro-light HRP化学发光检测试剂（TIANGEN公司）；其它所用试剂均为国产或进口分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人乳腺癌细胞株MCF-7复苏后，接种在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。当传3~4代，细胞状态稳定，长势良好时，用0.25g/L的胰蛋白酶消化，培养液稀释至合适浓度后，按5×105接种于培养瓶内，置于CO2培养箱中（5%CO2、95%空气、37℃）培养，24h后换液，以后每2～3d更换一次。

1.2.2细胞裂解和蛋白浓度的测定

当培养的细胞融合率达90%以上时，在倒置显微镜下选取长势相当的细胞6瓶，随机分为A组与B组，每组3瓶。倾去培养液，PBS冲洗2遍，沥干。每组分别加入对应的细胞裂解液A（50mM pH7.4 Tris-HCl，150mM NaCl，0.1%SDS，1%NP-40，1 mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM）与B（50mM pH7.4Tris-HCl，150mM NaCl，0.1% SDS，1%NP-40，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM）各200μl，缓慢吹打约5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脱色摇床上振摇20min，4℃，12000×g 离心15min，取上清液按参考文献上的Bradford法进行蛋白质定量[1]。

1.2.3SDS-PAGE

各组样品均取其最大浓度测量管进行SDS-PAGE。分离胶浓度12％，浓缩胶浓度5％，每孔蛋白上样总体积20μl（蛋白∶上样缓冲液＝1∶1），加样时采取对称方式。浓缩胶100V，分离胶150V，以彩色预染标准蛋白marker做指示，电泳1.5h左右停止。取下凝胶，从中间处切为两半，一半用于Western blot，另一半置于固定液内固定30min，考马斯亮蓝R250中染色30min，最后脱色液多次脱色至背景干净为止。

1.2.4Western blot检测Twist和β-actin蛋白

将与胶等大的PVDF膜浸入100％甲醇中15s 至PVDF膜呈均一透明并下沉，取出膜同凝胶、滤纸一起浸入转膜缓冲液中平衡10min。在半干式电转移仪上按照从正极到负极的顺序依次放置3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸，每层均精确对齐并排除气泡，按1.5mA/cm2恒流转移50min。转移结束后，取出PVDF膜,1×TBST洗涤3次（5min/次），加入5％脱脂奶粉室温振摇封闭1h,弃封闭液，1×TBST 洗涤3次（5min/次）。对照彩色预染Marker分子量为34kD处将PVDF膜剪断，上端和下端的膜分别用β-actin一抗（1∶1000）和Twist一抗（1∶3000）室温孵育2h。之后1×TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次（7min/次），与HRP标记羊抗兔IgG二抗（1∶5000）室温振摇孵育1h，1×TBST缓冲液洗涤4次（7min/次）。最后在暗室内将混合的发光液加于PVDF膜上，进行压片、显影、定影，并利用Gel-Pro analyzer4.0软件对得到的图像进行分析。

1.2.5统计学处理

所得数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0统计软件进行方差齐性检验，组间比较采用t 检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1蛋白定量结果

各瓶上清液按Bradford法进行蛋白质定量，结果A组蛋白含量(1.88±0.08)g/L，B组蛋白含量(2.85±0.05)g/L，两组比较具有显著性差异（t=12.40，P< 0.01）。

2.2电泳分离获得的蛋白结果

SDS-PAGE电泳结果如图1，可见19kD到117kD间均有蛋白条带分布，但蛋白质条带颜色深浅与蛋白定量数据不一致。其中1～2泳道为A裂解液裂解得到的蛋白，4～5泳道为B裂解液裂解得到的蛋白。采用A裂解液法得到的蛋白条带颜色深度和清晰度均高于B法，尤其对于34kD以下的小分子蛋白表现更明显。

图1SDS-PAGE 电泳分析各组蛋白

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