毒理学水生毒性试验设计
设计一个环境水样中生物毒性的测 定”实验方案
设计一个环境水样中生物毒性的测定”实验方案1.一种生物毒性的检测方法，其特征在于，该方法按下列步骤进行：步骤一，样品处理：按照标准取样方法采取污水样，并对样品进行如下处理：(1)依次将7mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7mL的纯水通过C18固相萃取小柱对柱子进行润湿活化，(2)取500 mL经0.45μm滤膜过滤后的污水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱，并调节真空泵使流出液流速为3mL/min，(3)待污水样全部流出柱后用5 mL纯水过洗柱子，接着继续真空抽气干燥15 min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心，(4)用二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，然后用5mL体积分数为0.5%的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液，(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成系列浓度梯度的待检测样品溶液，步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：(1)将青海弧菌Q67菌种转接到50 mL液体培养基中，22℃条件下，培养10～12 h，(2)将得到的菌体培养液在12000 rmp条件下离心10 min后弃去上清液，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10 mL 0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp离心10 min，然后将经洗涤的菌体细胞用10 mL 0.9%的生理盐水重悬，得到青海弧菌Q67菌悬液，步骤三，污水样急性生物毒性的检测：对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：(1)在1.5 mL样品检测管中加入100μL待检测样品溶液，并取100μL 0.9%的生理盐水加入1.5 mL对照检测管中作为空白对照样，其中样品及空白对照样均有3~5个平行样，(2)上述各检测管中分别加入100μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s，(3)菌悬液加入完900 s后，采用发光细菌检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及对照样进行发光强度检测，读取其相对发光值，步骤四，结果计算：(1)计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E，(式A)(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小，(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50值越大，毒性越大，(式B)。
鱼类急性毒性实验
实验前24 h停止喂饲，每天清除粪便及食物残渣。驯养期间 死亡率不得超过10％，如果超过10％，则该批鱼不得用作实 验。
实验鱼应无明显的疾病和肉眼可见的畸形。
实验前两周内不应对其做疾病处理。
八、讨论与思考
1. 干扰鱼类LC50正常测定的因素有哪些？
2. 对一化学性质稳定的物质而言，试推测用
静态法、半静态法或动态法测定其对鱼类
(3) pH：6.0～8.0。
(4) 为避免对实验鱼不必要的扰动，实验液中溶解氧 > 4 mg/L。 (5) 水量：每克鱼0.5 L水以上。
2. 选自同一驯养池中规格大小一致的幼鱼。
实验前该鱼群应在与实验时相同的环境条件下，在连续曝气
的水中至少驯养两周。驯养期间每天投饵1次，每天换水1～
2次。
(2) 至少取6个容器，均加入标准稀释水。
其中一个为空白实验即对照实验， 以得到所要求的浓度范围。
表1 实验设计
浓度对数 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20
其余容器中加入不同量的储备溶液， 浓度系列(mg/L) (3) 向每个容器中放入10尾或更多的实 验鱼。每个容器设3个平行样。
害的危险性；
阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关 系与中毒特征。
二、实验内容
根据静态测定法，用鲤鱼为试验生物测定
毒物在48 h后引起受试鲤鱼群体中50％鱼致
死的浓度。
在24 h，48 h记录试验鱼的死亡率，确定鱼 类死亡50%的受试物浓度，用LC50表示。
三、实验原理
急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24 h内多次)接触 外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。
生态毒理学实验设计
姓名：刘金鑫学号：201428006037073 培养单位：地理所生态毒理学实验设计一.【实验题目】：砷对两种淡水藻类的毒性作用。
二.【实验设计思想】：砷在环境中是一种普遍存在的污染物，它来源于人为源和自然源的释放，通过一定的途径进入地表、土壤和饮用水体中。
通过目前的研究已经发现进入水体的砷对水中的生物存在影响，我们有必要研究水体中砷对水生生物的毒性作用，在这些研究中要数藻类的研究较多。
我准备通过使用72小时生长速率——一种抑制生物检测方法，来判定五价砷和三价砷对两种在无外来干扰的热带的淡水藻类（绿藻和单针藻）的毒性。
这个实验的意义在于，看砷对藻类的毒害作用是否很强，如果藻类对于砷的耐性较强，可以指导后面的藻类用于砷污染水体修复的研究。
三.【实验目的】：1、掌握藻类的室内无菌培养。
2、学会藻类生长速率测定的方法。
3、掌握72小时生长速率的检测方法。
4、判定砷对两种藻类的毒害作用。
四.【实验原理】：1、藻类的选取：由于不同种类的藻对砷毒性的反应不同，有的藻对砷比较敏感，而有的对砷的耐性较好，所以我选择了一种敏感性的单针藻和一种耐性较好的绿藻。
2、培养液的选择：为了排除自然水体和纯净水体的影响，我用人工合成的软水（内部成分以及含量都是已知的）来进行实验。
3、培养瓶的选择：为了防止砷在普通瓶体上的吸附，我选择250ml 的硼硅酸盐的锥形瓶。
4、检测前处理：将处于指数生长阶段（5-6天）的细胞通过离心（2500rpm，7min），超纯水洗涤三次确保培养液除去后，再用于生物检测。
5、培养条件：将培养瓶放在培养架上进行培养。
培养架周围的环境条件：27±1℃、12：12h的光照和无光、每天用手摇晃两次锥形瓶使其进行充分的气体交换。
6、通过多功能计数仪测定结果。
7、数据分析：通过线性插值法计算72hIC50。
8、藻对砷和磷的吸收具有竞争性。
五.【实验材料】：绿藻、单针藻、玻璃烧杯、天平、硼硅酸盐锥形瓶、镊子、酒精灯、量筒、真空过滤器、滤膜、试管、无菌操作台、吸管、多功能计数器、移液枪、PH试纸（PH5.4—9）、牛角匙、牛皮纸、棉花、纱绳、高压蒸汽灭菌锅、培养架、温度计、恒温室、冷光源、NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl、CaCO3、10%HNO3、超纯水、Na2AsO4·7H2O、NaAsO2、NaNO3、KH2PO4等。
生物监测项目四水体污染的毒性试验
2023《生物监测项目四水体污染的毒性试验》•试验目的•试验原理•试验方法目录•试验结果•数据分析与结论•建议与展望01试验目的探索水体污染对生物生长、发育和生存的影响；分析不同污染物对生物机体功能和代谢的损害；为水体污染治理和生态环境保护提供科学依据。
了解水污染对生物的危害评估污染物的毒性程度评估不同浓度和种类的污染物对生物的毒性影响；为水体环境质量评价和污染治理提供依据。
检测水体中不同污染物的含量和种类；监测水体污染的影响范围观察污染物质在水体中的扩散和迁移情况；分析污染物质在水体中的分解和转化过程；为水体污染的预警、预防和治理提供决策依据。
02试验原理生物监测是指利用生物体对环境污染物的吸收、代谢和排泄等过程进行的监测，以评估环境污染对生物体及人类健康的影响。
生物监测基本原理生物监测定义具有连续性、实时性、长期性等优势，能够及时反映环境污染物对生物体及人类健康的危害。
生物监测的优势生物监测结果影响因素较多，如环境污染物的种类、浓度、作用时间等因素，同时还需要考虑生物个体差异和环境因素的影响。
生物监测的局限性水体污染的毒性效应水体污染的定义水体污染是指人类活动排放的污染物进入水体，引起水质恶化，影响人类健康和水生生物生长的过程。
毒性效应的定义毒性效应是指环境污染物的毒性作用对生物体产生的影响，包括致畸、致突变、致癌等。
水体污染的毒性效应表现水体污染的毒性效应表现为对水生生物及人体健康的危害，如鱼类行为失常、生长异常、生殖能力下降等，以及人体接触污染水体后出现的急性中毒、慢性中毒等症状。
生物标志物是指生物体内暴露于环境污染物的特定化学物质，可以用于评估环境污染物的暴露和毒性效应。
生物标志物与毒性评估生物标志物可以反映环境污染物的暴露情况，评估其对生物体及人体健康的危害程度。
毒性评估的方法包括实验室试验和现场调查两种方法，其中实验室试验主要采用生物监测技术，通过观察生物体对环境污染物的吸收、代谢和排泄等过程进行评估；现场调查则主要采用流行病学方法，通过调查人群接触环境污染物的机会和健康状况进行评估。
生物监测项目四水体污染的毒性试验
数据分析
利用统计学方法对数据进行深入分析，如单因素方差分析、相关分析等。
结果报告
撰写试验结果报告，总结分析结果，并提出有关建议和措施。
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试验结果
03
农药
农药如六六六、滴滴涕等对生物的毒性影响同样不可忽视，长期暴露可引起生物的免疫系统受损。
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结果分析
污染物毒性影响的分析
不同浓度污染物的毒性影响
随着污染物浓度的增加，生物体受到的毒性影响也相应增加。
不同生物种类对污染物毒性的敏感性
不同生物种类对同一种污染物的毒性敏感程度不同。
污染物毒性对生物生长的影响
污染物对生物生长的影响也是毒性影响的一个重要方面。
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有机污染物的毒性
有机污染物对生物的毒性影响主要表现在生物体内的积累和代谢过程中。
推广生态修复技术
加强环保宣传教育，提高公众的环保意识和环境保护责任感，鼓励公众积极参与水体保护和环境保护工作。
提高公众环保意识
THANKS
感谢观看
数据处理
03
试验流程
准备试验所需试剂和仪器
采集水样
预处理水样
准备阶段
按照试验要求，将试剂溶解于水样中，以制备试验溶液。
配置试剂
将试验溶液加入试验容器中，观察和记录生物毒性反应情况。
进行生物毒性试验
对试验结果进行统计分析，包括计算毒性系数、IC50等指标。
统计分析
试验阶段
数据处理与分析阶段
数据整理
不同污染物对生物的毒性影响
01
重金属
重金属如铅、汞等对生物的毒性影响较大，可影响生物的神经系统、生长和繁殖等。
水质的生物毒性检测方法
Vol. 31, No. 4, 2012 Water PurAifuigcuastti2o5nthT, 2e0c1h2nology
水质的生物毒性检测方法
高小辉 1，杨峰峰 2，何圣兵 2，戴鼎立 2，陈雪初 2，李玫芳 2
（1.杭州西湖风景名胜区管委会，浙江杭州 310013；2.上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240）
Vol. 31, No. 4, 2012
细胞，甚至靶分子的正常生理功能，观察受试物对 其产生的作用，从而提供毒理学资料的方法。近年 来，分子生物学的飞速发展带动了体外试验研究的 进步。国内外广泛使用的体外试验方法有：多种微 生物诱变试验，各种器官灌流，不同组织薄片培养， 各种细胞包括单个细胞或其他亚细胞结构的培养 等[7]。
李彬等20用斜生栅藻和明亮发光杆菌对重金属污染土壤进行生态毒性评估结果显示发光菌的相对发光度以及斜生栅藻的增殖率与土壤中的重金属含量均有明显相关关系并且比较所测参数后认为斜生栅藻细胞增长率是最为敏感的土壤毒性表征指标
净水技术 2012，31（4）：49-54
净水技术 WATER PURIFICATION TECHNOLOGY
[收稿日期] ２０１１－11-05 [基金项目] 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2009ZX07106-
2-2）；上海交通大学大学生创新实践计划（IPP3087） [作者简介] 高小辉（1966-），男，高级工程师，学士，研究方向为园林
景观生态。 [通讯作者] 何圣兵，电话：021-34203734；
体外试验方法的主要缺点为各种微生物或细 胞的培养都是在离体条件下，难以精确地模拟或反 映外源物在生物体内的生物转运和生物转化过程; 敏感度不佳，需要富集系数在 15~30 之间[12]；无法得 到毒效学或毒代动力学的资料。但体外试验可用来 测量生物体某一特异性毒效而不受机体多种复杂 因素影响。根据试验目的和需要，可选择不同种属 动物的器官、组织，细胞株（系），细胞受体等，探索 毒性作用机制，为整体动物试验提供线索和依据。 该法可使试验中的剂量和对化学品的暴露期更精 确化，可使试验的物化环境参数得到更精确的限定 和控制，具有简便、快捷以及可直接利用人体细胞 等优点，因此能在短时间内对化学物品的潜在毒性 进行评估。
毒理学实验设计模板
毒理学实验设计模板一、概述毒理学是研究化学物质对生物体产生的毒性效应的科学。
毒性实验是毒理学研究的重要手段之一，通过设计合理的实验，可以评估化学物质的潜在毒性，为毒性评估和风险评估提供科学依据。
本文将介绍一个毒理学实验设计模板，以帮助研究人员设计可靠、准确的毒性实验。
二、实验目的明确实验的目标，可以有多个目的，例如：1.评估化学物质对特定细胞系的细胞毒性；2.确定化学物质对实验动物的急性毒性；3.研究化学物质在生物体内的代谢过程。
三、实验设计1. 实验类型根据实验目的，确定实验类型，可以有以下几种类型：1.细胞毒性实验：使用细胞培养技术，评估化学物质对细胞的毒性效应；2.急性毒性实验：在实验动物中测定化学物质的急性毒性；3.代谢动力学实验：观察化学物质在生物体内的代谢过程。
2. 样本选择根据实验类型，选择适当的样本，可以有以下几种样本：1.细胞系：选择与研究对象相关的细胞系，例如癌细胞系、正常细胞系等；2.实验动物：根据研究目的选择合适的实验动物，例如小鼠、大鼠、猴子等。
3. 化学物质选择根据实验目的和样本选择，确定实验所需的化学物质，包括测试化合物和阳性对照物质。
4. 实验组设计根据实验目的，将实验样本分为实验组和对照组，其中实验组接受待测化学物质处理，对照组接受无处理或阳性对照物质处理。
5. 实验参数测定根据实验目的和实验类型，确定需要测定的实验参数，可以有以下几种参数：1.细胞毒性实验：测定细胞存活率、细胞增殖率等；2.急性毒性实验：测定动物的中毒症状、存活率等；3.代谢动力学实验：测定化学物质在生物体内的浓度、代谢产物等。
6. 数据处理和统计分析对实验数据进行统计分析，计算实验参数的平均值、标准差等。
根据实验目的，选择合适的统计方法，如t检验、方差分析等。
四、实验步骤1. 实验准备准备所需的实验设备、试剂和动物。
确保实验环境的安全和洁净。
2. 细胞毒性实验步骤1.培养细胞：将细胞悬浮液加入培养皿中，培养到适当的细胞密度。
生态毒理学1 (3)
第一节常规毒性试验一、急性毒性试验急性毒性试验是研究化学物质大剂量一次染毒或24h内多次染毒生物所引起的毒性试验。
其目的是确定化学物质的毒性程度以及剂量—反应关系，确定此化学物质与其他化学物质的相对毒性，确定具体的急性毒作用以及提供毒作用模式方面资料，并为进一步开展其他毒性试验提供理论依据。
一项设计合理的急性毒性试验，可以得到用以计算LD50的资料。
(一)水生生物急性毒性试验1．鱼类毒性试验鱼类急性毒性试验，是水生生态毒理学的重要内容之一，并广泛应用于水域环境污染监测工作中，对控制工业废水的排放，保护水域环境，发展渔业生产，制定渔业水质指标，具有重要意义。
(1) 试验用鱼的选择应具有代表性，便于在实验室条件下饲养的当地经济鱼类，对毒物敏感，个体健康。
短期试验多采用我国的青鱼、草鱼、鲢鱼及鳙鱼四大养殖淡水鱼，一般体长在7cm以下为宜。
也可采用金鱼，一般在3cm以下。
选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍舒展完整、逆水性强和食欲好的当年鱼种，在实验室内驯化培养7—10天使用(2) 试验条件试验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼2—3L为宜，水的PH值为6.5—8.0，冷水温度为12—18℃，温水温度为20—28℃，一次试验中水温变化范围为±2℃。
水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清洁的河水、湖水或放置3天以上的自来水。
（3）半数致死浓度（LC50）的测定先做预备试验，确定100％致死浓度和不引起死亡的最大浓度，然后以此浓度范围，按等对数间距确定5-6个浓度组，另加一空白对照组，每组10-20尾鱼，染毒48-96h。
染毒刚开始8h内经常观察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期观察，记录中毒反应及死亡时间。
死亡鱼立即取出剖检。
试验期间保持溶解氧、pH值、水温等条件的稳定。
根据24h、48h、96h各组鱼的死亡数，按LC50计算方法，求出相应时间的LC50 。
一般采用直线内插法或对数-概率模式法。
鱼类的急性毒性实验
C实o验m用pa水ny的L水og质o1条m件一g般/是L指、水的0温.度1、mpHg、溶/L解氧。、硬每度、个水中浓的有度机物放和水入量等五。 条鱼，可用静态
方式进行，不设平行组，试验持续48～96h。每日至 3．实验用水（稀释水）及水质条件
选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。
鱼类的急性毒性实验
1
目的与要求
2
实验原理
3
实验材料
4
实验步骤
5
实验报告
6
注意事项
1
通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设 计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析 和报告等全过程。
2
鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污 染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如 行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。 在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液， 实验至少进行24h，最好以96 h为一个实验周期，在24h、 48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡 50％时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水 环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评 价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应 表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定 化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理 的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理 废水排放提供环境依据。
试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完 整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何 疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都 不得作试验鱼。
3
2．实验仪器设备 （1）实验容器
实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族 箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每 升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类 幼鱼可选择500mL或 1000mL烧杯为实验容器。容器的深 度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用 相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器 上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所 有毒性残留物。 （2）其他
毒理学实验一 鱼的急性毒性试验
08100049毒理学实验一、鱼的急性毒性实验背景知识急性毒性实验的主要目的是确定化学物质的毒性程度、剂量―反应关系，根据待测化学物质与其它已知毒性化学物质的相对毒性,推定具体的理化性质，测定其急性毒作用,以及提供毒作用模型方面的资料。
此外,这种研究也能指出化学物质可能的靶器官及其特异性毒作用,并对亚慢性毒性试验研究中所用剂量提供指南。
外源化合物的毒作用往往通过某一染毒持续时间的半致死量/浓度 (LD50/LC50), 或化学物质在空气中某一染毒浓度的半致死时间(LT50)，或用半数效应量 (ED50或 (EC50) 来估计表示（注：化学物质在水中浓度对水生生物如无脊椎动物、鱼虾的死亡不易鉴别时使用）。
水生生物的急性毒性试验广泛应用于水域环境污染监测工作中, 对控制工业废水的排放，保护水域环境，制定水质标准，发展水产品的生产，具有重大意义。
受试生物的急性实验有下列四种方式进行暴露试验即静态、循环、更新、动态, 但最常用的方法是静态与动态方法。
可提供下列的观测指标：①估计产生毒性作用的上限浓度，②估计不同种的水生生物对受试物的相对敏感性，③估计大量受试物的相对毒性，④估计水质对受试物毒性的影响(pH、溶解氧、盐度、硬度、悬浮物)。
⑤得出浓度―反应关系曲线及暴露时间的意义,动态实验可提高保持令人满意的实验条件的能力, 而且没有时间的限制。
因此它能给出暴露时间―反应关系比较完美的估计。
水生生物的急性毒性的实验应当设计成为能得到计数标准的反应(有或无,生与死)，受试污染物浓度与暴露生物中受影响生物的百分比之间的关系，可画出浓度―死亡率曲线。
急性实验结果可表示每一实验浓度中死亡或不动生物的百分比; 从观察内插法或计算中得出 LC50，或 EC50及相应的 95% 的置信区间。
实验目的本实验通过观察在不同受试物浓度处理下，鱼的急性中毒表现和经过，了解和基本掌握测定毒物的半数致死剂量/浓度（LD50/LC50）的方法，了解受试物剂量和生物反应的关系及计算表示方法。
水生生态系统藻类毒性实验
实验原理
生物测试能够弥补化学和物理的检验的不足，目 前水生生态系统藻类毒理试验已经成为许多国家 对环境质量监测的标准方法之一而得到广泛应用 ，影响藻类生长的主要因子包括阳光、二氧化碳 、温度、PH及氮、磷、微量元素等营养成分。水 环境中的这些生态因子的变化会刺激或抑制藻类 的生长，而导致水体初级生产力的变化。如果外 来有毒有害化学物质进入水体，藻类的生命活动 就会受到影响，生物量也随之发生变化。
（3）生物量的测定测定藻类生长的指标有多种，要考虑所 有相关的环境因素以及自己试验的目的和条件来选择指标
常用的测试指标有：干重、光密度、细胞计数、叶绿素a 含量的测定（减压过滤一定体积的藻类培养液到玻璃纤维 滤片上，加入1mL的MgCO3悬浮液后将水抽滤干净，把滤片 放到一个组织研磨管内的底部，加入2mL的90%的丙酮，弱 光下淹没1-2min，再用5mL的90%的丙酮把残留的样品洗入 15mL的有螺旋盖的离心管中，离心（2000g）1-5min，静 置于暗处1-2h，是色素充分被抽提，离心，将上清液在分 光光度计上，用1cm的比色皿分别读取750、663、645和 630波长处的吸收率，并以90%的丙酮作对照校正吸光度， 依据P298的公式计算得叶绿素的浓度。）
3 藻类预培养 将事先准备的藻种移种至盛有培养基的三角瓶中，在试验 确定的温度和光强条件以及无菌条件下，培养2-3周，使 藻类达到同步生长阶段。用离心机离心收集培养物中的藻 细胞，去除上清液，在沉积的藻细胞中加入 1再0次mL离N心aH，C悬O3浮溶，液再（离15心g，/L）悬使浮藻，细经胞此悬处浮理于的此藻溶悬液浮中物，作 为试验藻接中原。
实验结果与报告
计算EC50设各组平行样品生物量的平均值分别为V空白,，V1 ，V2，V3，V4,，…，Vn，在半对数坐标纸上以受试毒物浓 度为纵坐标y，以（ V空白- Vn ）/ V空白为横坐标x，用内 插法计算生物量下降50%的毒物浓度，即相应时间段的EC50
水中二恶英类物急性毒性实验
食品毒理学课程实验设计方案方案名称：水中二噁英类物急性毒性实验及其检测实验方案设计报告学生姓名：龚鹏班级：食品科学与工程12-1班学号：2012218633指导教师：马飞日期：2015年11月9日水中二噁英类物急性毒性实验一、实验鱼的选择和驯养1实验鱼的选择斑马鱼：斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼，体型小，在较小空间内就可饲养大量斑马鱼(2L的鱼缸中就可饲养10条左右)。
斑马鱼世代周期短，繁殖率高，饲养管理廉价方便，饲养成本低，对水质的要求不高。
因此斑马鱼长期以来被广泛用于胚胎学、发育生物学、毒理学和分子生物学等研究,被喻为理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型,是四大模式生物之一,也是国际标准化组织(ISO)推荐使用的标准化鱼类毒性实验动物和我国国家环保部、化学农药环境安全评价准则指定的鱼类毒性实验鱼种之一。
拟购得斑马鱼150条。
同批、同种、同龄,大小均匀,体质健壮,个体全长以1.0～6.0 cm为宜,最大个体不可大于最小个体的50%。
2实验鱼的驯养实验鱼用于试验之前,在与实验用水质、温度和光照相同的水中驯养7 d,以使鱼类适应实验室的生活环境,如水温、水质和光线等,且便于对实验鱼进行健康选择。
驯养期间,应每天换水、喂食1～2次,实验开始前24h停止喂食。
密切检查鱼的健康状况,发现受伤、体色异常、消瘦、离群游泳、行动呆滞和拒食等现象,应及时除去。
驯养开始48 h后记录死亡率,死亡率小于5%方可用于实验。
二、实验条件实验用水（稀释水）：自来水，人工曝气或放置3 d以上脱氯。
水的总硬度为10～250 mg/L(以CaCO3计),pH值为6.0～8.5。
实验容器：其他实验室的鱼缸三个，以及2L的烧杯四个，洗净后用曝气后的自来水涮洗。
三、实验步骤进行预实验后再进行正式实验1预实验：预备实验用于确定正式实验浓度的大致范围,了解实验溶液浓度的稳定性,以及实验过程中pH、溶解氧等变动情况。
如果能从同系物毒性或文献资料估计被测试化学物质或工业废水的大致毒性,可直接进行正式实验。
实验二 鱼类急性毒性实验
实验二鱼类急性毒性实验一、实验目的（1）掌握鱼类急性毒性实验的原理和操作（2）掌握半致死浓度的计算方法二、实验原理鱼类对水环境的变化十分灵敏，运用毒理实验方法，观察鱼类在含有化学污染物的水环境中的反应，可以比较不同化学物质的毒性高低。
鱼类毒性实验方法可分为静态方法和动态方法两大类。
静态实验方法操作简单，不需要特殊设备，适宜于受试化学物在水中相对稳定，在实验过程中耗氧量较低的短期实验。
动态实验方法要求具备一定的设备，对于在水中不稳定、耗氧量较高的化学物需要进行较长时间的实验观察时，可采用动态实验方法。
本实验介绍静态实验方法。
三、实验器材玻璃缸或搪瓷桶、重金属盐、金鱼四、实验步骤（1）预备实验：预备实验的方法，可参考有关资料初步估计3～4个浓度，每个浓度用3～4尾鱼，观察24～48h。
进行预备实验的目的是确定实验浓度的范围（找出引起实验鱼全部死亡和不引起实验鱼死亡的浓度）；观察鱼中毒的表现和出现中毒的时间，为正式实验选择观察指标提供依据。
同时还要做一些化学测定，以了解实验液的稳定性、pH值、溶解氧的变化情况，以便在正式实验时采取措施。
（2）正式实验：1、根据在预备实验中得到的浓度范围，其间距按等比级数插入3～5个中间浓度实验中至少选择5个不同浓度，一般以7个浓度较常用，但所选择的浓度应包括有使实验鱼在24h内死亡的浓度，以及96h内不发生中毒的浓度。
表中第1纵行包括的浓度最常用。
实验中无论采用何种分组方法，都必须同时设对照组。
配制实验液时应先配制少量高浓度的储备液，实验时临时稀释所需浓度的实验液。
先把药液与水均匀混合后，再放入实验鱼，禁止先放入实验鱼后往实验缸中加受试药液，以免实验鱼接触到不均匀的高浓度的药液而提前死亡。
2、结果的观察：实验开始后8h进行连续观察并做好记录，8h后可做24h、48h和96h的详细观察记录。
实验过程中发现有特殊变化应随时记录。
观察指标包括理化指标和生物指标。
理化指标是水的溶解氧、pH值、水温、硬度等，用以检查实验条件的稳定性，排除由于实验条件的变化可能带来对实验鱼的影响。
海洋鱼类水生态毒性试验方法与设计方案
本技术公开了一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，包括：选择虾虎鱼作为试验的鱼类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养，准备待测水样储备液，先通过虾虎鱼的急性毒性和慢性毒性预试验分别筛选浓度梯度范围，设置差距小的浓度梯度，以海水作为对照组，待测水样作为试验组，同时进行虾虎鱼的急性毒性和慢性毒性试验，记录虾虎鱼和环境的变化，对数据进行方差分析，绘制虾虎鱼死亡率曲线，结合虾虎鱼的体征情况和水体指标变化判断水质毒性；克服目前国内对于鱼类毒性试验研究较为单一，没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法的问题。
权利要求书1.一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在与待测水样水质条件相同的标准水中驯养海鱼；(2)以海水作为对照组、待测水样作为试验组，在不同毒物浓度梯度条件下进行急性毒性试验和慢性毒性试验，试验过程中海鱼禁止喂食，并保持对照组和试验组水质条件不变、鱼体大小相同，光照充足；其中：所述急性毒性试验包括：将驯养后的海鱼装入1.5升海水的容器中，每组海鱼数量为10尾，每个毒物浓度梯度设置两组平行，采用流水式，水流流速为20mL/min，试验时间为96小时，保持温度为22-25℃、pH为7.6-8.0、溶解氧大于60％，并分别在0、24、48、72和96小时观察并记录急性毒性试验过程中水质指标和海鱼生长指标的变化；所述慢性毒性试验包括：将驯养后的海鱼装入800毫升海水的容器中，每组海鱼数量为10尾，每个毒物浓度梯度设置四组平行，采用半静态式，试验时间为7天，每间隔24小时分别从每个容器中取出150毫升溶液，再加入150毫升与试验开始设置浓度梯度相同浓度的溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6和7天观察并记录所述慢性毒性试验过程中水质指标和海鱼生长指标的变化；(3)对步骤(2)中所得数据进行分析，判断水质毒性；其中，所述海鱼包括虾虎鱼；所述水质指标包括pH、溶解氧和温度；所述海鱼生长指标包括存活数量、体重和体长；所述毒物包括硫酸钠和萘。
实验二 斑马鱼的急性毒性实验
二、实验原理
在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液 ，以96h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记 录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度 （LC50)。 通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能 产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼 类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定 水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水 质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。 我国可采用的实验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、 鲢鱼和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼、斑马鱼等 。本实验选用斑马鱼作为实验材料
（1）实验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化状况 。
（2）受试物质名称、来源、物化性质和保存方法。 （3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。 （4）实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。 （5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、受试 生物数目。
（6）计算实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC50值， 及其毒性分级。
2学物质的急性 毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级， 如下表所示：
鱼类急性毒性实验毒性分级标准
鱼起始LC50/（mg/L）
＜1 1~100 100~1000 1000~10000
剧毒 高毒 中等毒
低毒
＞10000 微毒
3、编写报告
在实验报告中应包括：实验名称、目的、实验原理、实验 的准确起止日期，以及：
• 斑马鱼(zebrafish)是一种小型热带淡水鱼 ，最早是作为胚胎发育生物学和遗传学的 实验动物模型，被广泛地运用于早期胚胎 发育基因表达调控的研究。
三、实验材料与试剂
1、 斑马鱼，购自绍兴花鸟市场，体重0.15g左右， 体长2.8cm，实验前在充分曝气的自来水中驯养7 天。
环境毒理学——鱼类毒性试验
表3-1 不同溶液浓度和不同培养时间下鱼类的死亡率
死亡率 0h 24h
C1
C2
C3
C4
C5
48h 72h 96h
确定半数致死浓度（24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50），并记录无死亡 的最大浓度和导致鱼类全部死亡的最小实验浓度。鱼类急性毒性试验不仅用于测定 化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质 标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。 返回
环境毒理学——鱼类毒性试验
4 实验材料与实验条件 4.1 实验鱼的选择与驯养
对污染物敏感
在生态类群中具有代表性 经济价值比较高
斑马鱼是国际上通用的鱼 类急性毒性实验鱼种。本实 验以斑马鱼为实验鱼。建议 的实验温度21-25℃，建议 实验鱼的全长2.0±1.0cm。
原则
来源丰富、取材方便 遗传稳定、生物学背景资料丰富 体积大小适中 在室内条件下易于饲养和繁殖
环境毒理学——鱼类毒性试验
2 目的与要求
通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设 计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和 报告拟写等全过程。
环境毒理学——鱼类毒性试验
3 实验原理 污染物浓度达到一定程度
鱼类对环境反映灵敏 引起中毒
行为异常
生理功 能紊乱
组织细 胞病变
死亡
环境毒理学——鱼类毒性试验
6 实验报告 6.1 数据处理
用直线内插法或常 用统计程序计算出 24h、48h、72h、96h 的半致死浓度（LC50） 值，并计算95％的置 信限。 如果试验数据不适 于计算LC50，可用不 引起死亡的最高浓度 和引起100％死亡的最 低死亡浓度估算LC50 的近似值，即这两个 浓度的几何平均值。
水体污染的毒性试验.
2. DO：不能低于4mg/L 3. 水温：21～25℃ 4.光照: 12—16h 5. 试验用水:未污染的自然的河水或湖水，需 过滤去悬浮物，或用标准稀释水 。如用自来 水，要暴气。
水的硬度: 19～250mg/L (以CaCO3计) ； pH： 6.0—8.5
四、试验步骤
1. 预备试验
目的:
在全生活周期的慢性毒性试验中对生物不产生影响的浓度。
24hLC50 0.3 安全浓度= (24hLC50 / 48hLC50 ) 3
48hLC50 0.3 安全浓度= (24hLC50 / 48hLC50 ) 2
安全浓度=96LC50×（0.1～0.01）
不易分解的取0.01～ 0.05；容易分解的取 0.05～0.1
2果评价
N--供试的动物总数（死亡率为0和 100%的组不计在内）
96h LC50（mg/L） 毒性分级
<1 极高毒
1～10 高毒
10～100 中毒
>100 低毒
3.编写报告
六、鱼类急性毒性试验结果的应用
(一) 安全浓度的推导
安全浓度:就是在污染物的持续作用下，鱼类可以正常存活、 生长、繁殖的最高毒物浓度
高
5. 极限试验
可以进行浓度为100mg/L的极限试验。如极 限试验结果表明LC50>100mg/L。可直接给出 试验结果及评价：LC50>100mg/L，属于低毒。
五、数据处理与报告
1. LC50计算
（1）直线内插法
对数浓度
（1）直线内插法
废水 10 百分 6 率浓 度（
5 4 对数 尺度 3
毒物下所产生的可观察的生物效应。
测试项目
生长情况（体长和体重） 存活时间 幼体产生数量
水生生物毒性试验
水生生物毒性试验水生生物毒性试验进行水生生物毒性试验可用鱼类、溞类、藻类等，其中以鱼类毒性试验应用较广泛。
鱼类对水环境的变化反应非常灵敏，当水体中的污染物达到肯定浓度或强度时，就会引起一系列中毒反应。
例如，行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变，直至死亡。
鱼类毒性试验的重要目的是找寻某种毒物或工业废水对鱼类的半致死浓度与**浓度，为订立水质标准和废水排放标准供给科学依据；测试水体的污染程度；检查废水处理效果和水质标准的执行情况。
有时鱼类毒性试验也用于一些特别目的，如比较不同化学物质毒性的高处与低处，测试不同种类鱼对毒物的相对敏感性，测试环境因素对废水毒性的影响等。
这种试验可以在试验室内进行，也可以在现场进行。
依据试验水所含毒物浓度的高处与低处和暴露时间的长短，毒性试验可分为急性试验和慢性试验。
急性试验是一种使受试鱼种在短时间内显示中毒反应或死亡的毒性试验。
所用毒物浓度高，持续时间短，一般是4天或7—10天。
其目的是在短时间内获得毒物或废水对鱼类的致死浓度范围，为进一步进行试验讨论供给必要的资料。
慢性试验是指在试验室中进行的低毒物浓度、长时间的毒性试验，以察看毒物与生物反应之间的关系，验证急性毒性试验结果，估算**浓度或*大容许浓度。
慢性试验更接近于自然环境的真实情况。
毒性试验方法可分为静水式试验和流水式试验两大类。
前者适用于测定和评价由相对稳定、挥发性小，且不过量耗氧的物质所造成的毒性，所需设备简单，毒物及稀释水消耗量少，但鱼类的代谢产物积累在试验水内，毒物浓度会因被代谢产物、器壁吸附等而降低。
实际工作中，常实行每隔肯定时间换一次试验水的方法。
流水式试验方法是连续不断地更新试验用水，适用于BOD负荷高、毒物挥发性大或不稳定的水样。
试验过程中溶解氧含量充分，毒物浓度稳定，可将代谢产物连续排出，试验条件更接近于鱼类所习惯的自然生活条件。
但是，这种方法需要较多而杂的设备，试验水消耗量大。
中、长期的慢性试验一般都采纳流水式试验法。
水生生态系统藻类毒性实验
不常用词解释
半对数坐标纸:横坐标或纵坐标轴是按照相等的指 数变化来增加的，（距离来说：如果每1cm代表 10的1次方增加，则坐标轴刻度依次为0，10， 100，1000，10000。。。。） 检验的不足，目 前水生生态系统藻类毒理试验已经成为许多国家 对环境质量监测的标准方法之一而得到广泛应用， 影响藻类生长的主要因子包括阳光、二氧化碳、 温度、PH及氮、磷、微量元素等营养成分。水环 境中的这些生态因子的变化会刺激或抑制藻类的 生长，而导致水体初级生产力的变化。如果外来 有毒有害化学物质进入水体，藻类的生命活动就 会受到影响，生物量也随之发生变化。
4 预备试验 目的在于探明毒物对藻类影响的半数有效浓度（EC50）的 范围，为正式试验打基础。 5 正式试验 (1) 试验浓度的选择 按等对数间距取5-7个毒物浓度，其中必须包括EC50并在 此浓度上下至少各设2个浓度，另设一个不含毒物的空白 对照。各浓度组均设3个平行样。 （2）种的制备和接种量 取上述达到同步生长的藻类培养液充分摇匀，取样计数细 胞密度后，用吸管转移相应体积的细胞悬浮液到受试水样 中。 （3）生物量的测定测定藻类生长的指标有多种，要考虑所 有相关的环境因素以及自己试验的目的和条件来选择指标
常用的测试指标有：干重、光密度、细胞计数、叶绿素a 含量的测定（减压过滤一定体积的藻类培养液到玻璃纤维 滤片上，加入1mL的MgCO3悬浮液后将水抽滤干净，把滤片 放到一个组织研磨管内的底部，加入2mL的90%的丙酮，弱 光下淹没1-2min，再用5mL的90%的丙酮把残留的样品洗入 15mL的有螺旋盖的离心管中，离心（2000g）1-5min，静 置于暗处1-2h，是色素充分被抽提，离心，将上清液在分 光光度计上，用1cm的比色皿分别读取750、663、645和 630波长处的吸收率，并以90%的丙酮作对照校正吸光度， 依据P298的公式计算得叶绿素的浓度。）
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某化合物A,在水中溶解度10%,在丙酮中的溶解度为100%,不挥发.在pH<6时易水解.
(1)设计水生生物的急性毒性实验
(2)如果测定含A物质的废水急性毒性,应该如何进行.
毒理学设计性实验
由于化合物A在生产和使用的过程中随着工业废水,农药径流流入水体,对水生生物的生长和繁殖有着潜在的危害.容易造成水质,土壤,植被的污染.如果人们不慎饮用或是食用含有残余化合物A的污染水体或鱼类,将严重威胁人体健康.因此,在水生生物急性毒性实验中,研究该类化合物A在水体中的毒性机理具有必要性. 鱼是水生生态系统的重要组成部分,是人类主要的食物来源,所以,鱼类的急性毒理资料是常用的评价有毒化学物质和工业废水对水生生物危害的资料.在我国鱼类毒性实验中经常使用的有白鲢(Hypophthalmichthysmolitrix,),金鱼(Gold fish)、鲤鱼Cyprinus carpio、鲫鱼Carassius auratus等。
由于这些材料体型较大，饲养起来不是很方便，而且受到繁殖季节的限制难以常年获得。
而斑马鱼是国际标准化组织(ISO)推荐的实验鱼种，其个体较小，性成熟期短，繁殖能力强，价格便宜。
被广泛的应用于生命科学的研究，也是实验室标准毒理学检验最常用的实验动物。
1 实验方法与材料
1.1 实验材料
受试污染物：化合物A。
1.2 实验仪器
气相色谱-质谱联用，pH计(PHS-3B),溶解氧测定仪(JYD-1A)，水硬度计，温度计，电子分析天平,烧杯（25，50ml）、移液管（1，10ml）、量筒等。
1.3 实验用水
由于该化合物在水中的溶解度为10%，而在丙酮中的溶解度为100%，故采用丙酮作为助溶剂，丙酮助溶剂含量不超过0.1mg/L。
再加入10%的吐温-80乳化剂配成母液，实验用水为经活性炭过滤后强制充氧48h以上的自来水，溶解氧>5.4mg/L,pH值为6.4-7.0，水温(22±2)℃。
总硬度125~250mg/L(以CaCO3计)。
自然光照，实验周期96h，实验方式采用静水式，96h之内不更换试液。
1.4 实验生物
受试斑马鱼购于上海市杨浦区花鸟虫鱼市场，体长为(30.00±0.75)mm，体重量为（0.20±0.01）g.行为活泼，反应灵敏，无畸形，逆水性强。
鱼苗经w=5%食盐水消毒后进入实验室，用曝气48h的自然脱氮自来水在实验室经过驯养7~10d后方可实验，驯养期间死亡率应小于3%。
实验前24h停止喂饲，实验期间不喂食，每天清除粪便及食物残渣,保证每天实验期间光照12h。
2 实验方法
先做预实验，以确定化合物A对斑马鱼24h100%致死的最低浓度和96h不引起死亡的最高浓度。
实验在2L的烧杯中进行，设置间隔较大的浓度梯度，尽可能使LC50在设置的浓度范围内，每个浓度设平行。
实验开始后每隔一段时间观察记录，整理24h、48h，72h，96h观察记录，需要统计各容器试验鱼的存活情
从预实验得到的无死亡浓度和100%死亡浓度之间，以实验配置好的母液以及稀释水，按照一定的间隔设置6个实验浓度组（4.5mg/L, 5.0mg/L, 5.5mg/L, 6.0mg/L, 6.5mg/L, 7.0mg/L）和一个空白对照组（曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）对照组，每组设三个平行。
每组10条斑马鱼，以96h为一个实验周期，采用静水流的方式，在24h，48h，72h，96h后分别观察斑马鱼存活状况，并记录溶解氧、pH、温度情况，鱼的死亡情况及行为变化等等，还要及时捞出死鱼。
最终确定鱼死亡50%时受试物的浓度，半数致死浓度用24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50来表示，判断斑马鱼死亡需要用玻璃棒轻轻按压斑马鱼的尾部，如果没有反应即认为斑马鱼已经死亡。
求出概率单位与化合物A浓度对数的回归方程，计算出化合物A的LC50，具体结果见表3.
为中等毒性；1000~10000mg/L为低毒，>10000mg/L为微毒或无毒。
再以此判断含该化合物的废水的毒性.
关于含化合物A的废水毒性实验,实验设计废水浓度100％、50％、40％、20％、10％、5％和0(CK)7个处理，3次重复。
每组废水中均放入10尾斑马鱼,实验周期为96h,开始暴露前,试验鱼逐条测量全长和体重,各组之间试验鱼的全长和体重均无显著性差异.采用自然光照,对照组和实验组同时进行试验,试验期间每24h更换一次试液.为防止饵料影响,试验期间不喂食.每两小时观察记录1次斑马鱼的生活作息;分别于4h,8h,12h,24h,48h,96h时统计斑马鱼的死亡率.
50,
征参数。
（1）半致死浓度（LC50）：采用概率单位-质量浓度直线回归计算。
（2）安全浓度(SC):SC=0.1×各观察时段的半致死浓度。
（3）毒性累积程度（MAC）:MAC=某观察时段的半致死浓度差值/最初观察点与实验结束时的半致死浓度差值×100%。
分析斑马鱼对含A废水的蓄积
与降减动态。
（4）急性毒性单位(Tua)=100%/LC50
总结：在上环境毒理学的时候，老师讲到，对于水生生物的毒性试验的一般程序：1，实验条件的准备。
2，实验生物的选择与准备。
3，稀释水。
4，毒物准备。
5，测试方法选择与测试重点的确定。
6，实验浓度的选择与设计。
7，指标观测。
8，数据分析与统计。
9，得出相应结论。
综合比较来看，我还是紧紧围绕着这条主线走。
当然此次设计试验，除了结合平时尹老师课堂上所讲的知识之外，本人也查阅了大量的相关毒性实验文献，其中还有向刘树深老师请教，与同学们的交流的过程，个人感觉是学到了很多课本以外的东西，也体会到了实验设计的难度。
如同平常所做的实验，那些都是老师事前准备好实验步骤，我们只要依葫芦画瓢就行，自己思考的成分很少，在这种研究生模式的实验中，我觉得把实践和理论相结合起来就相当好，当然，这里面不可避免的存在一些问题，还希望尹老师能够不吝赐教。