细胞免疫组化步骤
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种常用的分子生物学技术，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和表达水平。
它可以帮助科学家深入了解细胞和组织的功能和病理改变，是研究和诊断疾病的重要工具之一、以下是免疫组化的操作流程简介：1.样本制备：根据实验目的，选择合适的样本，可以是细胞培养物、冻存组织切片或石蜡包埋的组织切片。
对于细胞培养物，通常直接进行固定处理，而对于组织切片，则需要进行脱水、清洁等预处理。
2.细胞固定：将细胞或组织切片进行固定处理。
常用的固定剂包括甲醛、醋酸乙酯和乙醇等。
固定过程中需要注意不同抗原固定条件的优化，以保持抗原的完整性和免疫反应的灵敏性。
3.抗原恢复：某些抗原在固定过程中可能会丧失其免疫原性，需要进行抗原恢复处理。
常用的恢复方法包括加热诱导抗原修复（如煮沸、蒸汽加热或微波辅助加热）和酶解法等。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前需要对样本进行非特异性结合的阻断处理，以减少背景信号。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶和奶粉等。
5.标记抗体：选择合适的一种一抗和二抗，一抗通常是用于识别目标抗原的物质，可以是单克隆抗体或多克隆抗体；二抗是特异性地识别一抗，并携带标记物，如荧光素或酶。
6.免疫反应：将样本与一抗和二抗进行免疫反应。
通常，一抗在特定的条件下与目标抗原结合，然后二抗与一抗结合。
标记物将被聚集在含有目标抗原的区域，形成可视化的免疫复合物。
7.信号增强：为了增强免疫反应的信号，可以使用信号增强剂，如生物素-亲和素体系和酶联免疫吸附法（ELISA）等。
这些方法可以增加检测的灵敏性和特异性。
8.示性显示：为了观察并记录实验结果，可以使用荧光显微镜、电子显微镜或者染色反应等方法来可视化免疫反应。
9.数据分析和解释：根据实验结果进行数据分析和解释。
通过比较免疫反应的强度和位置，可以确定目标抗原的存在和表达水平。
总结起来，免疫组化的操作流程包括样本制备、固定处理、抗原恢复、非特异性结合阻断、标记抗体、免疫反应、信号增强、示性显示以及数据分析和解释等步骤。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。
3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。
6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
细胞免疫组化
步骤（SP三步法，也可选择其它方法）：1、固定：4%PFA或丙酮甲醇1：1固定细胞爬片室温20min，然后用PBS洗3遍，3min/次；2、细胞通透：用终浓度为0.3%的triton（溶于PBS）通透细胞，约室温半小时；但丙酮可以省略这一步。
3、浸洗：PBS 3*3min/次；4、封闭：一般用5%羊血清（与二抗来源一致，但也可用BSA）室温封闭10-30min；5、一抗孵育：用合适的一抗浓度先4℃过夜，然后37度或室温复温45min；6、浸洗：PBS 5*5min/次；7、二抗孵育：用生物素标记的二抗孵育37度0.5-1h，或室温1-2h；8、浸洗：PBS 5*5min/次；9、SP反应：孵育37度0.5-1h；10、浸洗：PBS 5*5min/次；11、DAB显色：一般3-10min，具体时间由镜下看到背景来控制；12、苏木素复染、封片、镜下观察。
PBS 3*5 min/次，镜下观察细胞免疫组化的具体步骤:1.载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。
2.培养细胞也可涂片或贴片生长。
3.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定30分钟；对不能耐受甲醛固定的抗原，纯丙酮室温固定30分钟。
蒸馏水洗。
（干燥后可冰冻保存）4. 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次。
5.滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体, 不洗。
6．滴加适当稀释的一抗（小鼠或兔IgG），37 ℃ 1小时左右或20℃时2小时左右。
也可4℃过夜。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。
一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
）7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔、人IgG),20-37℃ 20分钟。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
细胞免疫组化步骤
细胞免疫组化步骤细胞免疫组化（cellular immunocytochemistry）是一种广泛应用于生物医学研究中的技术，用于检测和定位特定细胞或组织中特定抗原的存在。
该技术可以通过标记抗原、抗体和荧光等方式来观察细胞中的蛋白质表达水平和分布情况。
下面将介绍细胞免疫组化的基本步骤。
1.固定细胞：首先需要固定待研究的细胞样本，固定会杀死细胞并固定其内部结构和抗原。
常用的固定剂包括乙醛（4％）和甲醛（2％），可以通过浸泡细胞样本或使用压片法进行固定。
固定细胞的时间通常为10-30分钟。
2. 渗透化处理：固定细胞后，需要进行渗透化处理以增加抗体对目标抗原的进一步透入。
常用的渗透剂包括0.1％Triton X-100和0.1％Tween 20等。
渗透化处理的时间通常为5-10分钟。
3. 阻断非特异结合位点：为了避免非特异结合位点的干扰，需要进行非特异结合位点的阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、鱼皮胶（Gelatin）和牛血清白蛋白（BSA）等。
阻断处理的时间通常为1小时。
4.抗原抗体反应：在阻断后，进行抗原抗体反应，即使用特异性抗体与目标抗原结合。
抗体可以通过购买商业抗体或自制。
通常在4℃下进行抗原抗体反应，时间可以根据抗体的性质和抗原的表达水平而定，一般为2-24小时。
5.洗涤：反应后，进行多次洗涤以去除非特异性结合的抗体和嵌入在细胞表面的抗原抗体复合物。
用洗涤缓冲液（如PBS）进行洗涤操作，每次洗涤时间一般为5-10分钟。
6. 二次抗体标记：在洗涤后，还可以选择进行二次抗体标记以增强信号的检测和可视化。
二次抗体通常是针对第一抗体的抗动物类抗体，带有特定的标记物，例如荧光染料或酶联物质。
常用的二次抗体包括荧光标记的抗体（如FITC、Rhodamine）和酶标记的抗体（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP））等。
7.洗涤：与第5步相同，进行多次洗涤以去除非特异性结合的二次抗体。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
免疫组化简要步骤
免疫组化是一种用于检测细胞或组织中特定抗原的方法。
以下是免疫组化的简要步骤：
1. 样本固定：将待检测的组织样本或细胞样本固定在载玻片上，通常使用福尔马林或乙醇等化学物质进行固定。
2. 抗原恢复：对于一些组织样本，固定后的抗原可能会变性，需要进行抗原恢复步骤，以使抗原恢复其天然的形态和可检测性。
抗原恢复可以通过热处理、酶解或化学处理等方法实现。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫染色之前，需要使用一种非特异性抗体或蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
4. 抗体结合：将特异性的一抗（一般为单克隆或多克隆抗体）加入样本中，与待检测的抗原结合。
一抗可以是直接标记的，也可以是未标记的。
5. 洗涤：洗涤去除未结合的一抗，以减少背景干扰。
6. 二抗结合：加入与一抗来源不同物种的二抗，该二抗能够与一抗结合并标记有荧光素、酶或其他可视化标记。
二抗的选择取决于一抗的
种类。
7. 再次洗涤：洗涤去除未结合的二抗。
8. 可视化：根据二抗的标记方式，使用荧光显微镜、酶标仪或其他适当的设备对样本进行可视化。
9. 分析和解释：观察和分析样本中的标记信号，并根据标记的位置和强度来解释结果。
需要注意的是，具体的免疫组化步骤可能会因实验目的、样本类型和使用的抗体等因素而有所不同。
以上步骤仅为一般性的简要流程，实际操作中可能会有一些细微的差异。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
细胞免疫组化步骤
细胞免疫组化步骤细胞免疫组化听起来好像很专业很复杂，但其实啊，就像我们做饭一样，一步一步来，就能做出美味的菜肴啦！首先呢，咱得把细胞准备好，这就好比准备食材，得新鲜、合适才行。
细胞要处理得恰到好处，不能太“粗鲁”把它们弄坏了呀。
然后呢，就是切片啦，这就像是把食材切成合适的形状，要切得均匀、漂亮，这样后面的步骤才能更好地进行。
接下来，要进行抗原修复啦，这就好像给细胞来个“按摩”，让它们舒展开来，把隐藏的抗原都露出来。
之后就是封闭啦，就像给细胞穿上一件“保护衣”，不让那些不相关的东西来捣乱。
再然后，就是加一抗啦，这可是关键的一步哦，一抗就像是我们寻找目标的“探测器”，要精准地找到我们想要的那个抗原。
孵育一抗的过程可不能马虎，就像等待种子发芽一样，需要耐心和细心。
接着洗去多余的一抗，就像把杂质洗掉一样。
再加入二抗啦，二抗就像是一抗的“小助手”，能帮助一抗更好地发挥作用。
然后又是一轮孵育，让二抗和抗原充分结合。
洗去多余的二抗后，就该显色啦！这就像是烹饪中的关键时刻，调料一加，美味就出来啦！显色可要把握好时间和条件哦，不然可就“前功尽弃”啦。
最后一步就是复染和封片啦，就像给我们的作品加上最后的装饰，让它更加完美。
你看，细胞免疫组化步骤虽然多，但只要一步一步认真做，就一定能得到漂亮的结果。
就像我们做任何事情一样，只要有耐心、细心，就没有做不好的。
在做细胞免疫组化的时候，可不能粗心大意哦！要是哪个步骤出了差错，那可就像做饭盐放多了一样，味道就不对啦！所以啊，每一步都要格外小心，就像呵护宝贝一样对待这些细胞。
而且，不同的细胞、不同的抗原，可能需要一些小小的调整哦，这就需要我们不断地积累经验，就像厨师不断尝试新的菜品一样。
总之呢，细胞免疫组化虽然听起来有点难，但只要我们用心去做，就一定能做好，大家说是不是呀？。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。
免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。
以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。
-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。
2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。
常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。
3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。
因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。
4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。
6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。
二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。
7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。
8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。
9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。
然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。
10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。
可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。
此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
细胞免疫组化步骤
细胞免疫组化步骤2010-06-19 21:40:50细胞免疫组化SABC法步步看：细胞冻存够了,且状态良好咋们就开始做细胞免疫组化吧开始做实验了,先看要准备些什么吧实验准备：实验用品：移液枪：1ml、200ul、10ul枪头：1ml、200ul、10ul枪头盒：1ml、200ul、10ulEP管：湿盒需要灭菌的东西：培养皿可以是重复用的、细胞爬片多聚赖氨酸处理,并经过环氧乙烷消毒、常规细胞培养物品;试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS、3%H2O2现配、%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒血清封闭液、二抗、三抗SABC、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后,用完全培养基重悬4-5ml或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片圆片,圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上,注意不要滴到圆片外,让细胞贴片30min左右4、30min后,在培养皿中补加完全培养液轻微的加入,以免冲力将贴壁的细胞打下来,放于37°C,5%CO2培养箱中培养3h左右让其贴壁更牢;二、组化前处理1、取出培养皿,用PBS漂洗2x2minPBS可以不灭菌2、4%多聚甲醛处理室温20min；3、PBS漂洗,3x2min；4、%Txiton X-100 处理室温20min；5、PBS漂洗,3x2min；6、3%H2O2处理室温15min；7、PBS漂洗,3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液,37°C,20min；2、取出甩干封闭液不漂洗；一抗1：200PBS稀释,阴性对照用PBS代替一抗,37°C1-2h 或4°C过夜；3、PBS漂洗,3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C,20min；5、PBS漂洗,3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C,20min；7、PBS漂洗,3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂,我是按照500ul蒸馏水中各加4ul,混匀;在镜下观察显色情况,在没有背景色的条件下可继续显色;一般在2-10min9、自来水冲洗；10、苏木素复染,15-30s；11、自来水冲洗；12、封片剂封片有细胞一面对着载玻片,镜下观察若要长期保存片子,可以对爬片进行脱水处理：70%1次,1min-80%1次,1min-95%1次,1min-无水乙醇2x3min-二甲苯2x1min,观察是否彻底脱水,看观察片子放入二甲苯时,容器周围有白色雾状产生,若有则说明脱水不彻底;可重新进行得到结果：实验组中,细胞浆为棕黄色,细胞和为蓝紫色；阴性细胞中,只有核被染为蓝色,胞浆无色在此抱歉不能将图片上传,还得用来发文章之用在爬片时,圆片不好用镊子夹起,可在圆片之下垫上封口膜,这样操作起来即省事省时,又节约试剂的用量和提高试剂的有效性;。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤
1 前期准备
免疫组化实验试验主要是利用细胞中含有特定标志物的抗体，来观察细胞中某些特定蛋白质的位置和分布情况，其前期准备工作有以下几点需要考虑：
1、要做免疫组化实验必须首先准备一些*抗体,即抗特定标志物的抗体；
2、准备标本培养环境，保证细胞存活活跃；
3、清点实验要用到的必要物质，检查是否所有实验材料都已准备就绪；
4、准备实验记录，如实验方案、实验步骤、实验结果等，以保证实验数据的准确性和可比性。
2 具体实验步骤
免疫组化实验是实验员非常关注的一个实验，下面罗列出其具体实验步骤：
1、将标本培养到细胞形成一定规模的培养皿；
2、冷冻切割：将细胞悬停的溶液，用-20度的硫酸乙酸或三氯甲烷冷冻，然后将其分割为明显的薄片；
3、将冷冻标本培养到特定的沉淀液中，然后以石蜡改变其物理性质，使蛋白质定置固定；
4、将固定的载体实验片上滴涂稀释的抗体，经一定的反应时间，使其与抗原结合；
5、以使抗体以及它所结合的标志物发挥发色效果，得以定位特定的蛋白质。
免疫组化实验往往被用来观察某个蛋白质在不同细胞水平和组织水平分布情况，从而形成具有一定科学依据性的认识，为临床医学研究和药物方案提供可靠的指导和依据。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。
免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。
下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。
1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。
一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。
-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。
-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。
例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。
2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。
一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。
-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。
-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。
可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。
3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。
根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。
-荧光标记：如荧光素等。
-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
-金标记：如胶体金、纳米金等。
4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。
一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。
根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。
-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。
-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。
-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。
5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。
根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。
-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。
-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。
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（2010-06-19 21:40:50）
细胞免疫组化（SABC法）步步看：
细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！
实验准备：
实验用品：
移液枪：1ml 、200ul 、10ul
枪头：1ml 、200ul 、10ul
枪头盒：1ml 、200ul 、10ul
EP 管：
湿盒
需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙
烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：
细胞消化液、完全培养基、4彩聚赖氨酸、0.01M PBS（）、3%H2O（现配）、％Txiton X-100、浓缩型SABC式剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC ）、苏木素、ddH2O DAB显色试剂盒
操作步骤：
一、细胞爬片的制作
1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml ）或者密度为1-5x106/ml
2、在灭菌的培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠
3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min 左右
4、30min 后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37° C, 5%CO培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理
1、取岀培养皿，用PBS漂洗2x2min （PBS可以不灭菌）
2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；
3、PBS漂洗，3x2min ；
4、%Txiton X-100 处理（室温）20min；
5、PBS漂洗，3x2min ；
6、3%H2O处理（室温）15min ；
7、PBS漂洗，3x2min ；
三、组化
1 、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37° C，20min；
2、取岀甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1: 200）（PBS稀释），阴性对照用PBS弋替一抗，37° C1-2h 或4°C过夜；
3、PBS漂洗，3x2min ；
4 、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37 ° C，20min；
5、PBS漂洗，3x2min ；
6、SABC孵育：湿盒内37° C, 20min；
7、PBS漂洗，3x4min ；
8、DAB显色：DAB式剂盒中的A B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。
一般在2-10min
9、自来水冲洗；
10、苏木素复染，15-30s；
11、自来水冲洗；
12、封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），镜下观察
若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：
70%（ 1 次，1min）-80%（ 1 次，1min）-95%（ 1 次，1min）-无水乙醇（2x3min）-二甲苯
（2x1min），观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。
可重新进行！得到结果：实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色；阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色！在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用！
在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂的用量和提高试剂的有效性。