大分子与小分子的偶联

大分子与小分子的偶联

小分子物质本身不具有免疫原性，不能直接刺激动物机体产生特异性抗体。此外，小分子物质本身不能被现有的固相载体吸附（活性炭除外）。

参与偶联的基团不能对分子维持免疫原性、反应原性或生物活性十分重要。

影响大分子与小分子偶联的因素有但不仅限于：被偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量，缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH等（与大分子-大分子偶联类似）外，还有半抗原的稳定性、可溶性以及理化特性等。

可用作载体的蛋白有各种动物的血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白（OA）、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白等。

（甲胎蛋白？）

这些蛋白中的一级氨和三级氨（等电点分别为8和10）、苯酚基、巯基（等电点9）、咪挫基（等电点7）、羧基（等电点2~4）等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性，可与半抗原分子中的对应基团结合。

半抗原分子中可参与反应的基团：一定数量的游离基团，如巯基、氨基、醛基、羟基、羧基、酮基、苯酚基、咪挫基等。

由于半抗原的分子较小，必须优先考虑半抗原分子中可用于偶联的基团，然后考虑蛋白质分子中的可反应基团。要考虑该基团对于维持半抗原生物活性的重要性、该基团与半抗原生物活性中心（免疫决定簇）的距离以及在分子结构中的稳定性和反应活性等来决定。（太重要的不能用于偶联；离中心越远越好；结构不稳定的反应活性更高）

偶联剂的浓度应尽可能高一些，因此要缩小反应体积。

偶联条件包括：

1)半抗原、蛋白质和偶联剂在偶联反应中的相对浓度及其比例；

2)用于溶解半抗原、蛋白质和偶联剂的缓冲液成分、Ph及其离子强度；

3)偶联反应的温度和时间；

4)在某些特殊偶联反应中对半抗原或蛋白质采取的特殊保护措施等。

某些半抗原在自然状态下的稳定性，影响偶联剂和偶联条件的选择。同时还有半抗原的可溶性。偶联反应一般在持续搅拌的蛋白质、半抗原和偶联剂的混合液中进行。如果这三者的溶解度不一致（异相相容），则应选择合适的溶剂。有机溶剂，水溶液，二者的混合物。

大分子为酶时，必须选择适于维持酶活性不变的偶联剂和偶联条件（如pH、温度等）。

蛋白质分子所含反应基团（游离基团）的数目：

N=(Ca/Ma) / (100/Mp)

Ca：该氨基酸的百分含量

Ma：该氨基酸的分子量

Mp：该蛋白质的分子量

BSA与小分子偶联时，偶联效果通常为1:8~25

半抗原与蛋白质的偶联比率：并非越多越好，而是要有一定的范围。

用半抗原与酶偶联、制备半抗原酶标记物时，通常要求半抗原与酶的克分子比率在10左右。比率过高，会导致复合物中酶含量降低，因而削弱检测信号强度。相反，如果比例过低，也会因空间屏蔽作用阻碍酶标半抗原与抗体的免疫反应而降低测定的灵敏度。

载体蛋白分子中连接的半抗原分子数量，可以从1个到几十个，即可达到最优，比率各异。控制偶联比率，可以调节相对浓度、反应液的pH及添加封闭物质。

1分子中含有羧基或可羧基化的半抗原的偶联：混合酸酐法、CDI法和NHS酯法。

2分子中含有氨基或可还原硝基的半抗原的偶联：重氮化法，CDI法，二异氰酸盐法，戊二醛法，对硝基苯酰氯+重氮化等。

3分子中含有巯基的半抗原的偶联：马来酰亚胺法。溴乙酰胺。醋酸缓冲液+氧化氢。

4分子中含有羟基的半抗原的偶联：醇类的羟基转化为羧基

5分子中含有醛基或酮基的半抗原的偶联：转化为羧基，或者醛类与蛋白形成席夫碱形式再还原。

6其他半抗原的偶联

大分子-大分子的偶联产物：偶联比率不同的酶标记物、酶自身聚合物、抗体自身聚合物、游离酶、游离抗体、偶联剂、偶联副产物、保护剂以及缓冲液成分等。

大分子-小分子的偶联产物：酶或者蛋白质聚合物、偶联比率不同的酶标记物，游离酶或者蛋白质，游离半抗原，偶联剂，偶联副产物，或半抗原蛋白质结合物，保护剂，有机溶剂，缓冲液成分等。

纯化方法：离心，盐析，透析，凝胶层析（亲和层析）等。

离心法：离心速度，离心半径，温度最好在4℃

透析法：透析袋，透析液，不断更换透析液，使半透膜外保持低渗状态，还可用此法进行浓缩。

层析法：最常用的凝胶有交联葡聚糖（Sephadex G）、琼脂和琼脂糖等。所用葡聚糖型号越大，分离大分子物质的效果越好。通常，Sephadex G-25可除去分子量700以下的物质，Sephadex G-200可将分子量在5000-200000之间的物质分离开来。对于抗体自身聚合物，必须用离子交换层析或者亲和层析。

用亲和层析法纯化半抗原-酶标记物时，可将抗半抗原的抗体连接到Sepharose-4B载体上，制备抗半抗原抗体Sepharose-4B层析柱，加液，最后用另一种洗脱液解离酶标半抗原。保存偶联物：低温液态保存（-20℃，等量甘油或者硫酸铵），冻干保存（低温真空干燥），低温冷冻保存（-70或者80℃）。可加入防腐剂叠氮钠或者0.02%硫柳汞钠盐，对于含HRP

的，最好用0.02%硫柳汞钠盐。

过氧化物酶-IgG的纯化和保存与其他酶标记物的纯化，不同的理化性质对应不同的方法。半抗原-大分子偶联物的纯化：G-25，G-200，亲和层析柱，保存大同小异。

偶联物的质量评定：1浓度测定：紫外吸收法，Folin-酚法，双缩脲法，微量凯氏定氮法，燃料结合法和荧光法。2纯度鉴定和结构分析：红外吸收光谱图或者质谱分析。电泳。

偶联物中两种分子偶联比率的估算：分光光度法，同位素标记法，根据偶联物的分子量估算偶联比率。

偶联物如果用作免疫原，通常只需测定其浓度和偶联比率。但若是酶标记物，还必须测定其酶活性和免疫活性。对于纯化程度很高的酶标记物，酶活性很高，并且酶活性与免疫活性保持一致。因此测定酶标记物的酶活性和免疫活性，还可间接反映其纯化程度。

测定酶标记物中酶活性的方法与测定对应酶的活性方法一样，均是在一定条件下与酶底物反映，然后根据底物反映产物的光密度值来反映酶的活性。

类似孕酮-HRP标记物的酶活测定（微孔板法）：

用一定稀释度（抗体一般过量）的抗孕酮抗体包被96孔板，然后将酶标记物进行倍比稀释（12个梯度），分别加入孔中，每孔中25ul，同时在每孔中加缓冲液（0.04mol/L的PBS，pH7.2含BSA0.1%）100ul。37℃反映1小时，倒掉液体，洗5次，吸干，各孔加临时配制的底物显色。最后以酶标记物浓度（或稀释倍数）为横坐标，OD为纵坐标作图，得一曲线。找出OD为1所对应的酶标记物浓度（或稀释倍数），即得偶联物的免疫活性（单位为ng/ml或者1：n倍）。