免疫细胞化学ICC流程
免疫实验-ICC用细胞抗原的制备
ICC用细胞抗原的制备一、材料和试剂1、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；ddH2O 至1000ml ；高压灭菌,分装。
2、0.25%胰酶：称取EDTA 0.02g NaCl 0.8g KCl 0.04g 加三蒸水100ml溶解后加0.25g 胰酶,轻轻搅动,使胰酶溶解,不要产生泡沫,加酚红少许,调PH值到8.2-8.6,过滤除菌,分装10ml/管,-20℃保存,临用前预温到37℃。
3、诱导液(TPA)：12-邻-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)溶于丙酮，配成20mg/ml。
1、HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养,使密度达到90%2、倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次,用无菌吸管吸干PBS液。
3、加0.25%胰酶(从-20℃取出,在37℃预温)75平方厘米培养瓶加1ml,37℃温箱或有经验者可在酒精灯周围,控制温度约37℃左右,轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。
4、观察到细胞有松动,成流沙状下落;或在显微镜下观察,细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液15-20ml,终止反应。
5、轻轻吹打下细胞,使细胞单个分散,并充分混匀1500转/分离心5-10分钟,去掉上清液6、打散细胞,加10ml含血清DMEM完全培养液混匀,取10ul在显微镜下计数,计算细胞浓度。
7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1×104个/100ul,每孔(96孔)接种200ul(即2×104个细胞/孔),37℃CO2培养箱培养。
8、次日显微镜下观察,细胞是否完全贴壁(一般24小时可完全贴壁)倒去培养0.01M PBS液先二次(孔中加满PBS,轻轻倒掉)并在滤纸上扣干,反复3次)应注意加液的力度,不能太大,以免冲掉细胞,倒去上清液在滤纸上扣干水份,但保持细胞湿润。
免疫组织化学实验流程
免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。
以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。
抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。
实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。
二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。
将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。
在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。
三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。
加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。
用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。
四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。
可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。
五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。
将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。
需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。
因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。
免疫组织化学（IHC）技术实验介绍
免疫组织化学（IHC）技术实验介绍
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术
技术原理：
技术服务流程：
1、样本接收：新鲜标本、固定组织、石蜡块、石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片
2、实验步骤：脱蜡至水、抗原修复、多重封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、苏木素染色、脱水透明、封片
3、显微镜下观察结果、拍照分析
优势：
由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，免疫组化技术在肿瘤诊断和鉴别诊断中具有独特的优势。
IF步骤
IF/ICC实验步骤基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min。
（3）通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。
少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的目的有三：①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；③使标本易于保存。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
免疫细胞成像ICCIF实验流程指南-ThermoFisherScientific
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
传统的ICC技术使用显色法检测，酶结合抗体将显色底物在反应位点转化为有色沉淀。
然而，随着免疫荧光标记(Immuno uorescence, IF)的出现，越来越受到广泛的应用，在很多情况下，常常把ICC/IF(免疫细胞化学/免疫荧光)放在一起使用。
在我们的官网和本手册中，ICC通常也用于描述IF。
在ICC/IF分析中，细胞抗原可以用荧光直接标记的一抗(直接法检测)或二抗及酶偶联物等(间接法检测)来显示。
通过结合不同荧光标记抗体，多重ICC/IF还可以同时检测同一样品中的多种抗原。
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免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。
免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。
以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。
-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。
2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。
常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。
3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。
因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。
4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。
6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。
二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。
7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。
8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。
9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。
然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。
10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。
可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。
此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。
免疫组织(细胞)化学培训课件
孵育一抗
孵二抗试剂1 37度20分钟
孵二抗试剂2 37度30分钟
梯度酒精 二甲苯
血清封闭（试剂A）室温2 h
DAB显色 复染
脱水、透明 封片
免疫组织（细胞）化学
ABC
孵一抗
孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h
放 大 法
孵ABC液（试剂C） 37度40分钟
16
一抗
➢ 首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的 信息，选择所需试剂的型号
免疫组织（细胞）化学
27
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际 工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗 原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主 要是定位指标，与功能有关。
免疫组织（细胞）化学
28
一、阳性标记免疫特征：分"弱(+)、中(++)、强(+++)" 三级。免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）表现为淡黄 色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易 见。
➢ 孵育时间：可先选择短时间如2 h，若结果不理想， 则适当延长时间。但确定后不要更改。
➢ 孵育温度：室温为宜（25 ℃左右），如过夜则置 于4℃孵育，加二抗前复温至少0.5 h。37℃孵育 可能会使染色过强，或产生非特异性着色。
免疫组织（细胞）化学
18
对照
➢ 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做。 用于排除方法和实验系统有无问题；
物素含量高的组织抗原检测。
免疫组织（细胞）化学
5
内容
免疫组化* 免疫荧光 显微镜的使用
免疫组织（细胞）化学
6
二甲苯 梯度酒
精
即 用 型 二 步 法
免疫细胞成像ICCIF试验流程指引
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
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抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项在免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）等实验技术中，抗原修复是一个至关重要的环节。
它对于提高抗原的检测敏感性和特异性具有重要意义。
接下来，让我们详细了解一下抗原修复的方法以及需要注意的事项。
一、抗原修复的概念和意义抗原修复，简单来说，就是通过特定的方法，使在组织处理过程中被封闭或改变的抗原表位重新暴露或恢复，从而提高抗原抗体反应的强度和准确性。
在常规的组织处理过程中，如固定、脱水、包埋等，抗原的结构和性质可能会发生变化，导致抗原表位被遮蔽或破坏，影响抗体与抗原的结合。
而通过抗原修复，可以在一定程度上逆转这些变化，提高检测的效果。
二、常见的抗原修复方法（一）热诱导抗原修复（HeatInduced Antigen Retrieval，HIAR）1、水煮法将切片放入盛有修复液的容器中，在电炉或微波炉上加热至沸腾，保持一定时间。
这种方法操作简单，但温度控制相对较难，容易出现干片等问题。
2、高压加热法利用高压灭菌锅进行抗原修复。
在锅内加入适量修复液和切片，设定压力和时间。
高压加热法的温度和压力较为稳定，修复效果较好，但设备要求较高。
（二）酶消化法使用蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等，对组织切片进行消化处理。
酶的浓度和作用时间需要根据具体情况进行优化。
酶消化法适用于某些特定的抗原，但可能会对组织结构产生一定的破坏。
（三）微波抗原修复将切片放入含有修复液的容器中，在微波炉中进行加热处理。
微波加热速度快，但需要注意微波辐射的均匀性。
三、抗原修复液的选择常用的抗原修复液包括柠檬酸盐缓冲液（pH 60）、EDTA 缓冲液（pH 80 或 90）等。
选择修复液时，需要考虑抗原的性质、组织类型以及实验条件等因素。
一般来说，柠檬酸盐缓冲液适用于大多数抗原的修复，而EDTA 缓冲液对于某些金属离子相关的抗原修复效果较好。
免疫细胞化学技术经验
精心整理免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，(一)*-*-(二) *--*-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa 以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体(antibody,Ab)1*抗体。
---2*-*B淋巴--多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1) 动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-*-小鼠(1)*--)为最常用。
(2)**-弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant)-弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
免疫组织化学技术操作流程
免疫组织化学技术操作流程
1.组织固定处理：首先，需要收集需要检测的组织样品，并将其固定在载玻片上。
这个步骤常用的方法有冷冻切片和石蜡切片，其中冷冻切片适用于细胞和组织的蛋白质表达的快速检测，而石蜡切片适用于长期保存和形态学研究。
2.抗原修饰：对于固定的组织样品，需要进行抗原的修饰处理来增强抗原的可检测性。
这通常包括蛋白酶的消化和抗原恢复等处理。
3.抗体染色：在免疫组织化学技术中，使用特异性的一抗体来识别和检测感兴趣的蛋白质。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求来决定。
一抗染色的方法有直接法和间接法，其中间接法是最常用的方法，使用辅助抗体来扩大信号。
4.信号检测：在抗体染色后，需要对信号进行检测。
这包括使用化学染色，如荧光染色、酶联免疫吸附实验（ELISA）和辐射放射等。
其中最常用的是荧光染色，因为它具有较高的灵敏度和多色信号的能力。
5.显微镜观察：最后一步是对染色结果进行显微镜观察和图像分析。
通过显微镜观察可以确定特定蛋白质在组织中的定位和表达水平，并可以进一步进行信号定量分析和数据处理。
总的来说，免疫组织化学技术是一种重要的实验技术，可以用于检测组织中特定蛋白质的存在和定位，从而为进一步的分子生物学研究提供重要的信息。
虽然这个技术在整个操作流程中需要一些特定的试剂和设备，但它的结果可以为分子生物学和医学研究提供重要的支持。
免疫组化三部曲之第二部：手把手教你做IHC
免疫组化三部曲之第二部：手把手教你做IHC北京义翘神州实验万事屋手里有块腊肉，咋整？急，在线等！上个月，实验室的大师兄在组会上秀出了高质量的免疫组化图片后，我寻思着手里那块“腊肉”可以整点IHC图片，到时候放在paper上定是极好的。
可大师兄刚勾搭上了漂亮的小师妹，哪里有空教我这种土肥圆小白。
你说气人不？在我苦（死）口（皮）婆（赖）心（脸）的攻势之下，大师兄最终投降，甩来三个IHC实验操作要点，说是自己多年心血，便转身而去，只留下迷人的背影。
/迷妹脸如获至宝，已按奈不住激动的心情，迫不及待地拿出来和大家分享：切片前奏切片要求完整、均匀、无刀痕和无褶皱，厚度一般在3-5μm。
当室温过高时，为保持石蜡的硬度，可预先冷冻蜡块。
展片时要避免产生气泡，温度45℃左右为宜。
贴片后，放入60-65℃烘箱中烤片1-2h，有利于防止脱片。
蜡片调教play组织切片上的石蜡，会导致非特异性染色，故在染色前必须彻底脱蜡。
目前二甲苯的脱蜡效果最好，脱蜡时间15min，重复2次即可。
接下来需对切片进行复水操作，目的是利用乙醇的双溶性，洗去切片上的二甲苯，并保证与后续的水溶性体系相容。
分别用梯度乙醇（由高到低）浸泡，最后用蒸馏水清洗2次，具体操作如下图所示。
脱蜡复水的具体实验步骤抗原修复大戏抗原修复是免疫组化实验极为关键的一环，目的是暴露抗原决定簇，断裂交联，溶解变性蛋白，提高抗原检测率。
常见的修复方法分为高压修复、微波修复和酶修复。
其中，微波修复操作简单、方便快捷，值得推荐。
具体是将切片浸入修复缓冲液，先用中火，达到沸腾后，档位调低，一直处于似沸不沸的状态，保持15min，之后进行自然冷却至室温，再进行下一步的实验。
图源网络操作时不要让切片干涸，否则抗原可能完全丢失；而且加热后冷却15-30min，有助于个别未折叠的肽链恢复到原来的构型。
且慢要是看完这三条，我就搞懂了免疫组化，那你可真高看我了，哈哈哈~~快来参加免疫组化在线课堂，有专业老师手把手教你做实验。
免疫组化染色操作顺序
免疫组化染色操作顺序文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组织化学方法及原理
免疫组织化学方法及原理免疫组织化学方法及原理免疫组织化学（Immunohistochemistry, 简称IHC）是一种利用抗体识别组织中特定的分子结构或细胞膜分子的方法。
IHC方法具有高度特异性和灵敏度，可用于检测细胞分子的定位、分布和数量等信息，对于肿瘤的诊断和治疗、疾病的预后等方面有重要的应用价值。
下面介绍IHC 方法的原理和常用的技术流程。
1. 原理IHC方法的核心是利用抗体与其特异性抗原之间的反应来检测组织切片中的分子结构。
抗原可是蛋白质、多糖、脂质等生物大分子，而抗体则是人工制备的、具有特异性结构的免疫球蛋白。
IHC方法涉及到两种类型的抗体：第一抗体和第二抗体。
第一抗体通常是一种单克隆或多克隆抗体，可以与组织样本中的目标抗原结合。
第二抗体通常是一种针对第一抗体特定嵌合区的细胞因子，如辣根过氧化酶（horseradish peroxidase, HRP）等，可与第一抗体结合，并使化学物质产生可视化信号。
2. 技术流程IHC技术流程分为切片处理、抗体处理、荧光分析和图像采集等步骤。
首先，组织样本通过常规包埋和切片技术制备成双层组织切片，取出切片后，通过石蜡切片解除脱脂和重水成像等处理，使其透明且能够与抗体反应。
之后，将切片进行称重并放置在载玻片上，并通过特殊的组织学染色方法进行初始染色，以可视化组织结构和细胞类型。
第二个步骤，是将切片与第一抗体接触。
不同的抗体可以结合预期的抗原，包括细胞膜分子、细胞因子、细胞内结构等。
抗体和组织样本的共同定位，和抗体和抗原间的特异性结合是检测过程成功的关键。
第三个步骤，是将切片与第二抗体结合。
第一抗体一旦结合了样本中的特定蛋白质或其他分子，则可以使用携带细胞因子的第二抗体标记，在可见的目标区域发生可视化信号。
第二抗体通常与一种辣根过氧化酶分子结合，可以利用酶联技术受体显色法或荧光标记技术进行检测，并表现在切片表面。
最后，通过镜头和图像分析系统进行图像采集和分析，可以获得被关注的区域、荧光标记的颜色和强度等信息。
免疫组织化学技术
化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶 作用底物进行显色定位。
荧光免疫组织染色方法
• 使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组
织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵 敏度高、操作简单的优点。
• 缺点是染色组织片不能长期保存
IF常用荧光素
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FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nm Rhodamine：橙色，激发波长570nm；发射波长570590nm
免疫组化基本操作步骤 及需要的试剂
免疫组化基本操作步骤
Envision二步法操作步骤
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1、组织切片60℃预热 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） 3、抗原修复 4、PBS/T洗3次，5min/次 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） 6、PBS/T洗3次，5min/次 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） 8、一抗4 ℃孵育过夜 9、PBS/T洗3次，5min/次 10、二抗RT 30min 11、PBS/T洗3次，5min/次 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 13、充分水洗 14、苏木素复染核 15、1%盐酸酒精分化 16、充分水洗返蓝 17、脱水、透明，中性树胶封片
免疫荧光（细胞标本）
免疫组织化学 (石蜡切片) 免疫组织化学 (冰冻切片) 免疫荧光 免疫组织化学 免疫组织化学 (甲醇固定) 免疫组织化学 (PFA 固定标本)
IHC-FoFr
IHC-FrFl IHC-G IHC-Glut IHC-M
免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片)
免疫组织化学 - Free Floating 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections)
ICC
IF/ICC Q & A 免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂？ 固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙 酮等。
它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类 物质，因此产生通透效应。
另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲 醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从 而维持在原位上。
这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶 剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的 抗原性。
同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿 越膜结构与胞内抗原结合。
醇类固定的优势在于蛋白变性完全， 对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。
醇类固定的细胞不需 要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考 虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚 甲醛固定。
其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方 法，然后选择较好的一种。
免疫荧光，免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照？ 设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除 非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问 题。
（1）阴性对照 阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检 标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。
较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原 的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。
但这 样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针 对一抗的 PBS 对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染 色，这种阳性对照可验证 Protocol，排除实验过程中出现的差 错。
另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。
同 时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如 Flag, Myc, His tag 等。
什么是免疫荧光双标记，怎么进行荧光双标实验？ 免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种 不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。
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免疫细胞化学ICC检测流程
（本方法适用于贴壁型细胞作爬片及检测）
细胞片制作
1）细胞固定液
Carnoy固定剂配制方法：
无水酒精：氯仿：冰醋酸（乙酸）按照体积比6：3：1的比例混合
2）操作：
3-1消化贴壁细胞，镜下观察，一般一个T25的瓶子可以铺一个6孔板的量
3-2将盖玻片以镊子夹住一角，泡入酒精消毒后，火上烤几秒钟，冷却后放入6孔板中，要能差不多盖住孔的大部分面积为好
3-3将细胞放入孔中分散，避免污染
3-4待细胞贴壁长至60-70%盖片面积时（这个过程中可以根据试验设计，施加干扰因子或药物处理等。
具体时间由自己把握），即可倒掉培养液，取出盖片；
3-5盖片用PBS或双蒸水轻轻洗涤（注意：洗涤片子时力度不要太大，避免细胞脱落，以下的处理同）几次以去掉残留的培养液，要注意细胞片的正反面，不要弄反了。
3-6 将细胞片浸入上述固定液（根据试剂情况选择合适的固定液，一般推荐Carnoy固定剂），固定时间15-20分钟即可
3-7 取出细胞片，自然晾干，可以直接进行染色实验，接下述染色流程
如不染色则按照下列流程处理保存细胞片
3-8 将细胞片依次进入75%、80%、90%、95%、100%、100%酒精、二甲苯中各5分钟，取出
3-9将细胞片用透明胶带贴附在载玻片上（细胞片的两端用透明胶固定贴好就可以了）
3-10 放进冰箱冷冻室保存（-20度）。
一般可以保存10-15天时间，细胞不变形不溶解
染色
ICC二抗为福州迈新公司，KIT0305，浓缩型羊抗鼠/兔超敏SP试剂盒
1）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；
2）3%H2O2（以PBS缓冲液或甲醇配置）滴加在切片上，室温（18-30℃）静置10min；3）PBS洗2～3次各5min，故洗涤时动作不宜剧烈（以下相同）；
4）滴加正常山羊血清封闭液,室温10-15min。
甩去多余液体。
5）滴加一抗50μL，置于湿盒内，4℃抗体孵育过夜或者37℃，1h，防止切片干燥。
注：6）1×PBS洗3次各5min；
7）滴加试剂A（生物素标记的抗鼠/兔IgG）50μL，室温静置20M；
8）1×PBS洗3次各5min；
9）滴加试剂B（HRP标记的链霉亲和素）50μL，室温静置20M；
10）1×PBS洗3次各5min；
11）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度约3-5分钟；
12）浸入自来水终止显色；
13）苏木精复染，1%盐酸酒精分化（分化时间为1秒）；
自来水冲洗10min～15min，流水速度调到比较小的状态，勿直接对着细胞片冲洗，防止组织掉片；
入无水乙醇10，二甲苯透明10M；
18）中性树胶封片，镜检。