免疫细胞化学ICC流程

免疫细胞化学ICC检测流程
（本方法适用于贴壁型细胞作爬片及检测）
细胞片制作
1）细胞固定液
Carnoy固定剂配制方法：
无水酒精：氯仿：冰醋酸（乙酸）按照体积比6：3：1的比例混合
2）操作：
3-1消化贴壁细胞，镜下观察，一般一个T25的瓶子可以铺一个6孔板的量
3-2将盖玻片以镊子夹住一角，泡入酒精消毒后，火上烤几秒钟，冷却后放入6孔板中，要能差不多盖住孔的大部分面积为好
3-3将细胞放入孔中分散，避免污染
3-4待细胞贴壁长至60-70%盖片面积时（这个过程中可以根据试验设计，施加干扰因子或药物处理等。

具体时间由自己把握），即可倒掉培养液，取出盖片；
3-5盖片用PBS或双蒸水轻轻洗涤（注意：洗涤片子时力度不要太大，避免细胞脱落，以下的处理同）几次以去掉残留的培养液，要注意细胞片的正反面，不要弄反了。

3-6 将细胞片浸入上述固定液（根据试剂情况选择合适的固定液，一般推荐Carnoy固定剂），固定时间15-20分钟即可
3-7 取出细胞片，自然晾干，可以直接进行染色实验，接下述染色流程
如不染色则按照下列流程处理保存细胞片
3-8 将细胞片依次进入75%、80%、90%、95%、100%、100%酒精、二甲苯中各5分钟，取出
3-9将细胞片用透明胶带贴附在载玻片上（细胞片的两端用透明胶固定贴好就可以了）
3-10 放进冰箱冷冻室保存（-20度）。

一般可以保存10-15天时间，细胞不变形不溶解
染色
ICC二抗为福州迈新公司，KIT0305，浓缩型羊抗鼠/兔超敏SP试剂盒
1）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；
2）3%H2O2（以PBS缓冲液或甲醇配置）滴加在切片上，室温（18-30℃）静置10min；3）PBS洗2～3次各5min，故洗涤时动作不宜剧烈（以下相同）；
4）滴加正常山羊血清封闭液,室温10-15min。

甩去多余液体。

5）滴加一抗50μL，置于湿盒内，4℃抗体孵育过夜或者37℃，1h，防止切片干燥。

注：6）1×PBS洗3次各5min；
7）滴加试剂A（生物素标记的抗鼠/兔IgG）50μL，室温静置20M；
8）1×PBS洗3次各5min；
9）滴加试剂B（HRP标记的链霉亲和素）50μL，室温静置20M；
10）1×PBS洗3次各5min；
11）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度约3-5分钟；
12）浸入自来水终止显色；
13）苏木精复染，1%盐酸酒精分化（分化时间为1秒）；
自来水冲洗10min～15min，流水速度调到比较小的状态，勿直接对着细胞片冲洗，防止组织掉片；
入无水乙醇10，二甲苯透明10M；
18）中性树胶封片，镜检。