纤维素酶

纤维素酶的组成及性质
3 : β- 葡 萄 糖 苷 酶 (β-glucosidases , β-6 或 BG) 或 β-D- 葡 萄 糖 苷 一 葡 萄 糖 水 解 (EC3.2.1.21),又称纤维二糖酶(cellobiase, CB),它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素 糊精的非还原末端水解葡萄糖残基,生成葡 萄糖产物.它的水解速率随底物大小的降低 而增加,以底物为纤维二糖时水解速率最快 咖.严格地讲,β-葡萄糖苷酶不能算作纤维 素酶,但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的 反馈抑制作用.
纤维素酶的组成及性质
1:外切葡聚糖酶包括两类酶, 一类:是β-1,4-D-葡聚糖一葡萄糖水解酶,也称为纤 维素糊精酶(Ec3.2.1.74); 二类:酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases CBH), 即β-1,4-D-葡聚糖一纤维二糖水解酶(exo-B-1,4-Dglucanases,EC3.2.1.91),简称外切酶.CBH是纤维 素酶系中的重要组分,在天然纤维素的降解过程中起主 导作用,可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维 素,作用于无定形纤维素的非还原末端或还原端,水解 β-1,4一糖苷键,依次切下一个纤维二糖分子,生成可 溶的纤维糊精和纤维二糖.
纤维素酶理化特性
五:纤维素酶的多样性
产纤维素酶微生物一般不会只有 不会只有一类纤维素酶组分. 不会只有 试验证明,S.pulverhlentum培养液就包括五种内切葡 聚糖酶和两种不同的BG. T. emersonii 的胞外酶包括 三种BG,四种cx和五种外切酶.即使只产生一类纤维 素酶组分,也往往有多种不同的形式.Elena.S等报 道,一种白热担子菌(phanerochaete chrysosporium) 依靠碳源,能在细胞外,细胞内和细胞壁上产生三种 不同的BG,其相应的相对分子量分别为96kDa,98kDa 和114kna.同一微生物,也可能因为不同的地区来源, 不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别, 这 也 是 纤 维 素 酶 多 样 性 的 表 现 .
纤维素酶的发酵工艺
纤维素酶的分布非常广泛,主要有三个来源: 1微生物来源:主要有霉菌,担子菌等真菌,也包括细 菌,放线菌和一些原生动物.真菌中活力较高的是木 霉,黑曲,青霉和根霉等,细菌中有纤维杆菌,球形 生孢纤维粘菌等,目前研究较多的是绿色木霉和纤维 杆菌; 2是动物性来源:利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的 粗酶制剂; 3生物工程来源:迄今,人们已从40多种细菌和数种 真菌中克隆到了纤维素酶基因,并构建了这些酶的基 因文库.同时,利用基因工程手段对纤维素酶分子进 行改造,使其活性提高,耐受性增强.
纤维素酶的发酵工艺
玉米秸秆培养基适宜的含水量为1:(2—2.5)(w/w),麦秸培养 基适宜的含水量为1:(1—1.5),啤酒糟培养基的含水量为1:1. 靖德兵等采用均匀设计U15(58)和双温度培养法(前30 h恒温 30℃,后续恒温27℃)进行康氏木霉 康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素 康氏木霉 酶条件的研究,结果表明,应用双温度培养法进行康氏木霉固 体发酵生产纤维素酶时,在自然补给氧气,培养基pH值自然 (约6.5)并保持环境湿度约60%的条件下,72 h是适宜的发酵周 期.徐福建等提出了纤维素酶气相双动态固态发酵的方式:在 优化条件下(最佳压力脉冲范围,脉冲频率及气体内循环速率), 发酵温度得到较好地控制,910 cm高的填料层中最大温度梯 度为0.12 s℃/cm;以汽爆秸秆为底物,发酵水活度得到较好 的保持;动态培养发酵周期(60 h)比静态发酵周期(84 h)缩短了 1/3,酶活(20 136 IU/g)比静态酶活(10 182 IU/g)提高了1 倍,压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况均匀一致 且疏松,而静态固态发酵的料层中部几乎没有菌体生长.利用 气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础.
纤维素酶的作用原理
纤维素酶降解纤维素的部位优先发生在无定形区 的理论已得到普遍认可. 这种理论认为,首先内切型纤维素酶作用于纤维 β-1 4素分子内部的无定形区,随即水解β-1,4-糖苷键, 将纤维素分子截短,产生大量带非还原性末端的 小分予纤维素,随后外切型纤维素酶,又称纤维 二糖水解酶,作用于纤维素线状分子末端,水解 β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子.最 后,葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子.
菌种选育
采集到的土壤样本经无菌水洗涤后, 吸取 上清液梯度稀释,选取适当浓度涂布选择 培养基,挑选出几 株菌, 纯化保藏. 用 刚果红染色法在选择培养基中复筛, 挑选 出4株有较强纤维素水解能力的菌株, 液 体培 养基中发酵, 测其纤维素酶的活性, 选择其中酶活性最高的一株保藏备用.
发酵过程
纤维素酶的发酵工艺
纤维素的结构
什么是纤维素酶?
纤维素酶:纤维素酶是酶的一种,在分解纤维素时 起生物催化作用,是多组分酶体系,是具有纤维素 降解能力酶的总称. 按照纤维素降解微生物和纤维素酶系之间的关系, 可将纤维素酶系分为三类: ① 一是对天然纤维素的降解能力比较弱,但可大量 合成分泌到胞外的纤维素降解酶系,酶的组分是 游离的,如常见的木霉,青霉的纤维素酶系; ② 二是对天然纤维素降解能力强,但分泌到胞外的 纤维素酶系活力较低,如担子菌类等; ③ 三是对天然纤维素分解能力强,但基本无纤维素 酶分泌到胞外,如厌氧细菌的纤维素酶系.
纤维素酶理化特性
六:纤维素酶的诱导性 真菌纤维素酶是诱导酶,在诱导物存在下才能产 生.许多不溶性的纤维素,可溶性的纤维素衍生 物,一些低聚糖类以及某些单糖和二糖均可作为 纤维素的诱导物.Nisizawa研究发现,纤维素, 纤维二糖,槐糖,纤维索衍生物等都能诱导里氏 木霉和绿色木霉产生纤维素酶.然而值得注意的 是,纤维二糖,葡萄糖等低分子可溶性糖在低浓 度时有促进作用,而较高浓度时便开始抑制.当 然,对于不同微生物来说,同一浓度,同一物质 也可能有着不同甚至完全相反的作用.
纤维素酶理化特性
四:纤维素酶的最适ph值 纤维素酶酶活对环境pH值很敏感,不同菌种,不 同组分的纤维素酶最适pH值有差异.如曲霉,青 霉及木霉产生的酸性纤维素酶,一般在酸性环境 pH4.0～5.0有较高活性.田新玉从200余株嗜碱细 菌中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株N6227,其 酶反应的最适pH值为8.5.内切酶(cx)的最适pH值 为5.0～7.0;C1酶和BG最适pH值为5.0左右,BG在 pH值4.0～8.0时稳定.
纤维素酶的组成及性质
2:内切纤维素酶(endoglueanases,EG)或 内切葡聚糖酶,即内切1,4-β—D-葡聚糖 q一葡聚糖水解酶(endo-β-glucanasea, EC3.2.1.4),简称内切酶,也称cx酶, CMC酶.内切纤维素酶随即地水解磷酸膨 胀纤维素,羧甲基纤维素等无定形纤维素 的非定形区,无规则水解β-1,4糖苷键, 形成葡萄糖,纤维二糖纤维三糖和不同大 小的纤维糊精,为纤维二糖水解酶提供更 多 的 可 供 水 解 的 末 端 .
纤维素酶的发酵工艺
2 固体发酵设备浅盘发酵器
是比较常用的一种固态发酵设备,培养基经灭菌冷却后装入 浅盘,通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵,工业 化程度较低.固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐, 尤其是流化床式固体发酵设备,发酵效果将更好.Leabharlann Baidu
3固体发酵工艺流程
4 固体发酵工艺条件 固体发酵过程中的温度,湿度,时间,水分,pH 值等因素及其交互作用对发酵有显著影响,对周 态发酵而言,温度是首要因素.培养基及培养条 件的优化,是降低酶制剂成本,提高酶活,实现 其工业化生产的重要措施.一般认为利用真菌进 行固态发酵最好将培养基的起始pH值调为酸性, 这样有利于真菌的生长而抑制细菌的滋生.固态 发酵培养基的初始含水量,应视纤维素材料种类 不同而异.
方法
3 .滤纸酶( FPase ) 活性测定:试管底部预 先放置适当大小的滤纸( 约 5 0 mg ) , 加 入1mL样品与 1.5 mL柠檬酸一 Na 2 HP O4 缓冲液( 0. 2 mo l / L, p H5 . 0 ), 50℃ 保温 1 h,扣除本底,测定反应后还原糖的含 量. 酶活定义为上述条件下, 每小时催化 生成 lg葡萄糖的酶量为一个 U .
纤维素酶的发酵
作者:刘洋
引言
纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合 物,绝大多数由绿色植物通过光合作用合成.据 估计,地球纤维素每年通过光合作用的更新量约 为4.0X 1010吨. 纤维素是地球上最丰富的多糖物质,是植物细胞 壁的主要组分,占植物秸秆干重的l/3～l/2,也 是自然界存在的最多的一类可再生生物聚合物. 依赖于人们对纤维素酶的发现和认识.纤维素为 一种具有巨大潜力的.
纤维素酶理化特性
三:最适温度 酶反应存在一个最适温度.一般纤维素酶的最适 温度范围为40—60℃.纤维素酶各组分热稳定性 也存在差异,内切酶(Cx)的最适温度为50～60℃, 热稳定性好,在95℃时仍保留一般的酶活性;不 同来源的β—葡萄糖苷酶的最适温度均为50～60 ℃ .然而有研究报道,β—葡萄糖苷酶具有很高 的耐温性,在50℃保温60h,仍保持95%以上的活 性,最适温度为70℃.也有报道,康宁木霉中的 外切酶(C1)具有特殊的热稳定性,其最适温度为 40～60℃.
引言
全世界农作物秸秆年产量超过20亿吨,仅我国每 年秸秆产量就高达7亿吨.由于其中含有大量的纤 维素,营养价值低,难以被畜禽利用,因此只有 很少一部分用作饲料,少量用来过腹还田或直接 还田嘲,而大约有45%～47%作为燃料补充农村 能源不足,15%以烧荒形式烧掉或丢弃.秸秆直 接利用率较低,如不对这类纤维素废物加以有效 地利用,不仅会严重污染环境,而且也造成资源 的极大浪费,因此探索纤维素类废弃物的处理措 施,对其进行有效利用是21世纪的重大课题.
纤维素酶理化特性
二:等电点 等电点(pI)是蛋白质分子的重要理化特征. 纤维素酶系中各组分的等电点随菌种来源, 培养条件的变化而异. 一般认为,木霉属真菌产的CBHI的pI值约 为4.2,CBHII的pI值约为5.9.真菌EGI的 pI值约为4.7,EGUI的pI值为4.8～5.6(也 有报道约为7.47),BG的pI值约为7.5～8.5.
一:固体发酵工艺
1 固体发酵工艺特点: 固体发酵法又称麸曲培养法,是 以秸秆粉,废纸,玉米秸秆粉为主要原料,拌入种曲 后.装入盘或帘子上,摊成薄层(厚约1 cm),在培养室一 定温度和湿度(RH 90%一100%)下进行发酵. 其主要特点是发酵体系没有游离水存在,微生物是在有足 够湿度的固态底物上进行反应,发酵环境接近于自然状态 下的微生物生长习性,产生的酶系更全,有利于降解天然 纤维素,且投资低,能耗低,产量高,操作简易,回收率 高,无泡沫,需控参数少,环境污染小等.但固体发酵法 易被杂菌污染,生产的纤维素酶分离纯化较难.且色素不 易去除.
方法
1. 刚果红染色法 菌落长成后, 往选择平板 中加入适量 1×10 - 3g/mL的刚果红溶液, 染色 l h;弃去染液, 加入适量 lmo l/L的 NaCI 溶液, 洗涤 1 h . 菌体若能分泌纤 维素酶, 则在菌落周围会出现清晰的透明 水解圈, 依据透明圈与菌落直径比值的大 小选择产酶菌株. 2 .还原糖的测定 采用 3 , 5 — 二硝基水杨 酸法( DNS法) .
培养基
选择培养基以羧甲基纤维素钠( CMC-Na) 取代查 氏培养基中的蔗糖, 其余配方不变; 种子培养基为 0.7 5 %CMC - Na ,0 . 5 %蛋白胨, 2 2%吐温 8 0, 0 .0 3 %MgSO4 , CaCl2 , H2O, 0 MgSO O 微量 FeSO4 ,MnSO4 , ZnSO4 ,CoCI2 , 自然 p H; 发酵培养基为 0 .7 5 %CMC - N a , ( NH4)2SO4 , 2 %吐温 8 0 , 其余同种子培养基.
纤维素酶理化特性
一:分子量 不同来源,不同组分的纤维素酶分子量差别较大,其变化 范围很广. 目前普遍认为: 1.内切酶分子量介于23～146kDa;(但有研究认为)内切 酶相对分子量介于23～118kDa(胞内酶)和47～76kDa(胞外 酶). 2.真菌EG的两种异构酶,EGI的分子量约为54kDaEGⅢ的分 子量约为49.8kDa. 3.外切酶分子量介于38～118kDa,木霉属真菌产的CBH 1 分子量约为66kDa,CBHII的分子量为53kDa;13—葡萄糖 苷酶为90～l00kDa(胞内酶型)和47～76kDa(胞外酶型).