实验 测定核酸含量——紫外分光光度法

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实验 测定核酸含量——紫外分光光度法

一.实验目的：学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二.实验原理：DNA和RNA都具有紫外吸收的性质，它们的紫外吸收高峰在260nm处。其紫外吸收特性是由于它们含有的嘌呤环和嘧啶环中的共轭双键系统的特性所决定的。蛋白质分子中含有Trp、Phe、Tyr等有共轭双键系统的氨基酸，因此对紫外光在280nm处有吸收高峰，而在260nm处的吸收仅为核酸的1/10。纯核酸260nm与280nm吸收的比值RNA应为2.0，DNA为1.8以上。

核酸分子中无论DNA还是RNA，主链结构单一，呈现磷酸-核糖（脱氧核糖）的重复。由此通过测定核酸分子中磷的含量便可以基本确定核酸的含量。进而求出摩尔磷消光系数ε（P）来表示溶液中的核酸含量：

ε(P)=A260nm/CL

注：A260nm：为260nm处光吸收值；C：为每升溶液中磷的摩尔数；L：为比色杯内径 由于C=每升溶液的重量（W）/30.98，所以ε(P)=30.98×A260nm/WL

天然DNA的ε（P）为～6600；RNA的ε（P）为7700～7800。磷在DNA中占9.9%，在RNA中占9.5%。1μg/mlDNA溶液的光吸收值为0.020，1μg/mlRNA溶液的光吸收值为0.022。因此在260nm处测的未知样的光吸收值即可求出其含量。

通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA，或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。

三.仪器使用：

752型紫外可见分光光度计：在指定波长下，将机器预热20min，以参比液作空白，开盖调节透光率T值为0%；盖盖调节透光率T值为100%，转换功能键至A后，测定样品光吸收值。

四.操作步骤：

1.用盖玻片刮取DNA细末，精确称取n mg左右DNA粗制品溶于n×10ml的蒸馏水中（1mgDNA粗制品溶于10ml蒸馏水）。

2.在260nm波长下，以蒸馏水作空白，开盖调节透光率T值为0%；盖盖调节透光率T 值为100%，转换功能键后，测定其光吸收值A值。

五.结果计算：

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1.比消光系数法测定核酸含量

DNA浓度(μg/ml)=(A260nm/0.020×L) ×稀释倍数

DNA浓度(μg/ml)=

注： A260nm：为260nm波长下的光吸收值

0.020：为1μg/mlDNA在260nm波长下的光吸收值

L：为比色杯内径，在本试验值为1cm

稀释倍数：本试验样品未经稀释，值为1

2.核酸的百分含量

DNA%=(DNA浓度×溶解体积/DNA粗制品重量)×100%

DNA%=

注：溶解体积在本试验为10ml；DNA粗制品重量在本试验为1000μg