定量分析方法的验证
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第四章 药物定量分析与分析方 法验证
1 定量分析样品前处理方法
2 定量分析方法特点 3 药品质量标准分析方法验证
一、定量分析样品前处理方法
Pretreatment of sample used in quantitative analysis
1 概述 2 定量分析样品前处理方法
概述
泛影酸
碘番酸 碘苯酯
干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度 氧瓶燃烧法
百度文库
氧瓶燃烧装置及称样方法
A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其 折叠法 E.F.G.称取液体样品5方0m法m
空心
A B
30mm 7mm
13mm 20mm
7mm
C
166mm
E 25mm
滤纸
356mm
F 滤纸
尾部
D
G
氧瓶燃烧法
样品
吸收液
测定方法
电 化 学 检 测 、MS
定量分析方法的验证 ----------生物样品分析
（一）特异性 内源性物质不得干扰原药、代谢物
（二）标准曲线 r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延
（三）精密度和准确度 RSD≤15％、20％ 相对回收率85～115％（80～120％）
定量分析方法的验证 ----------生物样品分析
(4) 检测限（limit of detection， LOD）： 药物能被检出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=3:1)
(5) 定量限（1imit of quantitation，LOQ）： 药物能被定量测出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=10:1)
第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标
检验项目和验证内容：
项目内容
鉴别
杂质测定
定量
限度
准确度
＋
精密度
－
重复性 中间精密度
专属性②
＋ ＋①
＋
＋
＋
检测限
－③
＋
定量限
＋
线性
＋
范围
＋
耐用性
＋
＋
含量测定及溶出 量测定
＋
① 已有重现
＋
性验证，
＋
不需验证
中间精密
＋①
度
＋
② 如一种方
法不够专
－
属，可用
－
其他分析
方法予以
＋
补充
＋
③ 视具体情
况予以验
＋
证
概述
磺溴酞钠
CH3
1
CH3 C CCl3 2 H2O
OH 三氯叔丁醇
概述
富马酸亚铁
O C CH CH C O
O O O O-
Sb
-
OO
Sb OO
2K+ 3H2O
O C CH CH C O
酒石酸锑钾
概述
含金属有机药物
卡巴胂 金属有机药物
定量分析样品前处理方法
不经有机破坏的分析方法:
直接测定法－含金属或C-M不牢固的有机金属 经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）
加盐或其 柱法：离
他 子
试剂 交换 树
脂
、
氧
化
铝
、
XAD-2型 树 脂 、 活 性 炭 、 凝 胶、ODS
TLC( 或
原 PC)洗
位 脱
测定 洗脱
液
：比色 荧光
、UV 、
3.测 定
CC(Column
Chr
普 omatogr.)
通CC
洗脱液：比色、 UV、 荧 光
HPLC：UV、 荧 光 、
重复性:
同一实验室,同一人多次测定的精密度
中间精密度:
同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度
重现性:
不同实验室，不同人测定的精密度
(3)专属性（specificity）:
指有其他成分（杂质、降解物、辅料等） 可能存在情况下采用的方法能准确测定出 被测物的特性)。
第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标
(6) 线性与范围（linearity and range）： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围 线性关系：Y=a+bx （r=0.9999) 线性程度：相关系数
(7) 耐用性（robustness）: 测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度 影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH， 商品柱的品牌，柱温等
二、药品质量标准分析方法验 证
指导原则 药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则 药物稳定性试验指导原则 缓释、控释制剂指导原则 微囊、微球与脂质体制剂指导原则 细菌内毒素检查法应用指导原则
第三节 药品质量标准分析方法验证
目的：
证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求
含氟有机药物 NaAc 氟蓝
含氯有机药物 含溴有机药物
含碘有机药物
H2O
pH4.3 HAc-
Buffer 茜素
NaOH溶液
H或2ON2-aNOaHO液H液硫酸肼饱和液
NaOH液硫酸肼饱和液
分光光度法 银量法 汞量法
分光法
银量法 分光法
银量法 碘量法 汞量法 分光法
碘苯酯含量测定
取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破 坏，用NaOH T.S. 2ml与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后， 加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml， 用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴 蒸气，加KI 2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液 (0.02mol/L)滴 定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并 将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液 (0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2
第四节 生物样品分析的基本步骤
1. 药物从蛋白结合或缀合物中释出
⑴ 蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂 (乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀
⑵ 盐酸水解
⑶ 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素 (一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.0~11.0使肽 键降解)
2.净
化固溶 相剂
提 提
取 取
（四）最低定量限LOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax
直接回流后测定 碱化回流后测定 硫酸水解后测定 经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘）
碱性还原后测定法－如泛影酸 酸性还原后测定法－如碘番酸 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量
经有机破坏的分析方法
湿法破坏
HNO3-HClO4 HNO3-H2SO4 H2SO4-MSO4
金属以高价态存在
效能指标：
评价分析方法的尺度
效能指标包括:
精密度, 准确度, 检测限,定量限,选择性, 线性与范围, 耐用性
(1)准确度（accuracy）：
测量值与真实值接近的程度
表 示: 回收率 测定方法：回收试验
加样回收试验
(2)精密度（precision ）：
定 义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度 表 示：标准偏差(s), 相对标准偏差(RSD)
1 定量分析样品前处理方法
2 定量分析方法特点 3 药品质量标准分析方法验证
一、定量分析样品前处理方法
Pretreatment of sample used in quantitative analysis
1 概述 2 定量分析样品前处理方法
概述
泛影酸
碘番酸 碘苯酯
干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度 氧瓶燃烧法
百度文库
氧瓶燃烧装置及称样方法
A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其 折叠法 E.F.G.称取液体样品5方0m法m
空心
A B
30mm 7mm
13mm 20mm
7mm
C
166mm
E 25mm
滤纸
356mm
F 滤纸
尾部
D
G
氧瓶燃烧法
样品
吸收液
测定方法
电 化 学 检 测 、MS
定量分析方法的验证 ----------生物样品分析
（一）特异性 内源性物质不得干扰原药、代谢物
（二）标准曲线 r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延
（三）精密度和准确度 RSD≤15％、20％ 相对回收率85～115％（80～120％）
定量分析方法的验证 ----------生物样品分析
(4) 检测限（limit of detection， LOD）： 药物能被检出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=3:1)
(5) 定量限（1imit of quantitation，LOQ）： 药物能被定量测出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=10:1)
第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标
检验项目和验证内容：
项目内容
鉴别
杂质测定
定量
限度
准确度
＋
精密度
－
重复性 中间精密度
专属性②
＋ ＋①
＋
＋
＋
检测限
－③
＋
定量限
＋
线性
＋
范围
＋
耐用性
＋
＋
含量测定及溶出 量测定
＋
① 已有重现
＋
性验证，
＋
不需验证
中间精密
＋①
度
＋
② 如一种方
法不够专
－
属，可用
－
其他分析
方法予以
＋
补充
＋
③ 视具体情
况予以验
＋
证
概述
磺溴酞钠
CH3
1
CH3 C CCl3 2 H2O
OH 三氯叔丁醇
概述
富马酸亚铁
O C CH CH C O
O O O O-
Sb
-
OO
Sb OO
2K+ 3H2O
O C CH CH C O
酒石酸锑钾
概述
含金属有机药物
卡巴胂 金属有机药物
定量分析样品前处理方法
不经有机破坏的分析方法:
直接测定法－含金属或C-M不牢固的有机金属 经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）
加盐或其 柱法：离
他 子
试剂 交换 树
脂
、
氧
化
铝
、
XAD-2型 树 脂 、 活 性 炭 、 凝 胶、ODS
TLC( 或
原 PC)洗
位 脱
测定 洗脱
液
：比色 荧光
、UV 、
3.测 定
CC(Column
Chr
普 omatogr.)
通CC
洗脱液：比色、 UV、 荧 光
HPLC：UV、 荧 光 、
重复性:
同一实验室,同一人多次测定的精密度
中间精密度:
同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度
重现性:
不同实验室，不同人测定的精密度
(3)专属性（specificity）:
指有其他成分（杂质、降解物、辅料等） 可能存在情况下采用的方法能准确测定出 被测物的特性)。
第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标
(6) 线性与范围（linearity and range）： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围 线性关系：Y=a+bx （r=0.9999) 线性程度：相关系数
(7) 耐用性（robustness）: 测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度 影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH， 商品柱的品牌，柱温等
二、药品质量标准分析方法验 证
指导原则 药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则 药物稳定性试验指导原则 缓释、控释制剂指导原则 微囊、微球与脂质体制剂指导原则 细菌内毒素检查法应用指导原则
第三节 药品质量标准分析方法验证
目的：
证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求
含氟有机药物 NaAc 氟蓝
含氯有机药物 含溴有机药物
含碘有机药物
H2O
pH4.3 HAc-
Buffer 茜素
NaOH溶液
H或2ON2-aNOaHO液H液硫酸肼饱和液
NaOH液硫酸肼饱和液
分光光度法 银量法 汞量法
分光法
银量法 分光法
银量法 碘量法 汞量法 分光法
碘苯酯含量测定
取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破 坏，用NaOH T.S. 2ml与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后， 加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml， 用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴 蒸气，加KI 2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液 (0.02mol/L)滴 定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并 将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液 (0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2
第四节 生物样品分析的基本步骤
1. 药物从蛋白结合或缀合物中释出
⑴ 蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂 (乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀
⑵ 盐酸水解
⑶ 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素 (一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.0~11.0使肽 键降解)
2.净
化固溶 相剂
提 提
取 取
（四）最低定量限LOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax
直接回流后测定 碱化回流后测定 硫酸水解后测定 经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘）
碱性还原后测定法－如泛影酸 酸性还原后测定法－如碘番酸 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量
经有机破坏的分析方法
湿法破坏
HNO3-HClO4 HNO3-H2SO4 H2SO4-MSO4
金属以高价态存在
效能指标：
评价分析方法的尺度
效能指标包括:
精密度, 准确度, 检测限,定量限,选择性, 线性与范围, 耐用性
(1)准确度（accuracy）：
测量值与真实值接近的程度
表 示: 回收率 测定方法：回收试验
加样回收试验
(2)精密度（precision ）：
定 义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度 表 示：标准偏差(s), 相对标准偏差(RSD)