1、动物细胞传代培养与观察实验报告

动物细胞传代培养与观察实验

实验目的

了解动物细胞传代培养的基本原理，熟练掌握动物细胞传代培养的基本操作。

实验原理

传代培养是组织培养常规保种方法之一。贴壁细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按一定比例稀释后，分种到新的培养瓶中继续培养，这一过程就叫细胞传代。

胰酶是一种蛋白酶，通过在特定位置上降解蛋白，将细胞膜和培养皿壁结合处蛋白降解，使两者分离，贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。

实验材料与用品

1、材料：培养皿，移液枪，枪头，移液管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，酒精喷壶，HELA细胞。

2、药品：培养基(DMEM含10%胎牛血清），0.25％胰蛋白酶。

3、仪器：二氧化碳培养箱（37℃，5%C02），倒置显微镜，超净工作台。

实验步骤

1、进入无菌室前准备：在进入无菌室之前穿好实验服，用肥皂洗手，75％酒精擦拭消毒双手，进入无菌室之后双手带上乳胶手套，用酒精消毒。

2、观察细胞状态：于倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

3、预热培养基：将培养基和胰蛋白酶置37℃水浴锅内提前预热。

4、超净台紫外消毒：超净台台面应整洁，打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧，点燃酒精灯。

5、消化前准备：将预热的培养基和胰酶外表用酒精消毒后放入超净工作台内；将培养皿从二氧化碳培养箱中取出后放入超净工作台内。

6、细胞消化：用移液枪吸出培养细胞的旧培养基，将胰蛋白酶瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后开盖置于酒精灯旁，每个培养皿加入1 mL胰蛋白酶，小皿用量酌减。轻晃。

在倒置显微镜下观察细胞脱壁情况，视情况可放入37℃的培养箱中孵育（有助于细胞脱壁），当细胞收回突起变圆时立即进行下步实验。

7、制备细胞悬液：吸出胰蛋白酶液，加入新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁制成细胞悬液，并根据比例分散到多个新培养皿中。

8、稀释分装细胞：在加入细胞悬液的三个新的培养皿中，分别补加一定量的新鲜培养基(5～10 mL／皿），并摇晃使细胞分散均匀，做好标记。

9、细胞继续培养：将细胞培养皿放入二氧化碳培养箱中继续培养。

10、收拾台面：关掉酒精灯，将培养基和胰酶放回冰箱，用酒精棉球擦拭台面，关掉超净工作台。

注意事项

1、在实验前紫外照射无菌室20min以上；

2、及时观察细胞形态，健康细胞的形态饱满，细胞铺满皿底的80%-90%时进行传代，太密容易死亡，太少不易生长。

3、在细胞传代时要严格注意无菌操作，盛放液体类的容器在开盖之前要在酒精灯火焰上烘烤，关盖之前也要在酒精灯火焰上烘烤一下。

4、培养用液严格分开，加液时吸管勿碰用过的培养瓶瓶口，及时更换枪头。

5、消化时注意胰酶的用量要适中，胰酶太多，细胞会受损，胰酶太少消化不下来。及时观察细胞形态，切勿消化过度。

6、传代后的细胞要做好标记，标记传代日期。

7、实验结束后要及时清理台面。