论人类基因治疗类型和策略

论人类基因治疗类型和策略

摘要：基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。遗传病的基因治疗(Gene Therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。

关键词：基因治疗；策略；遗传病

随着人们对微观世界的认识，生物医疗技术也步入分子时代，基因治疗技术迅猛发展。基因治疗是在微观的世界里，将外源的正常基因导入靶细胞，使外源基因挥发作用，从而弥补自身基因的缺陷。这里就会涉及到几个关键的步骤，首先我们怎么获取外源基因，其次外源基因要放在什么东西里，然后以什么方式导入缺陷细胞，最后我们又如何保证外源基因正常工作（表达）呢？

这就涉及了基因治疗的类型和策略。本文主要讨论RNA干扰技术，慢病毒载体技术和纳米生物技术在人类基因治疗中的应用。

纳米基因载体一般由具生物兼容性、可生物降解的纳米生物材料制备,基本无毒性,无免疫原性,体内可以代谢降解,生物安全性好。纳米脂质体主要由磷脂及胆固醇合成,磷脂和胆固醇本身是细胞膜的主要成分,由于其自身的仿生物膜的特点,可以通过其与细胞膜的融合或/和胞吞作用将目的基因导入细胞。高分子纳米材料如聚乳酸( PLA) 聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、壳聚糖(chitosan)等作为基因治疗载体目前已受到广泛的关注。用这些纳米生物材料制备而成的基因治疗载体具有良好的生物兼容性和生物降解性。PLA、PLGA最终在体内降解为二氧化碳和水,已经被美国FDA批准可以作为临床药用的辅助材料,作为化疗和基因药物载体展现了良好的临床应用前景。

加强基因治疗的靶向性,是目前基因治疗面临的挑战之一。靶向性基因转移载体可有效提高了基因传递的特异性,降低治疗副作用。纳米基因载体靶向性可分为主动靶向性和被动靶向性。由于纳米基因载体在肿瘤、炎性病变部位组织毛细血管通透性明显高于正常的毛细血管,可选择性地在病变部位渗漏,实现被动靶向基因传递,但这种靶向治疗的特异性不强。纳米基因载体的比表面积大,并且可在其表面偶联靶细胞的配体或抗体,实现基因治疗的主动靶向性。主动靶向载体大大提高了基因传递的特异性,并加强了靶细胞对目的基因的摄取。

由慢病毒改建而来的载体系统以其高效而稳定的基因转移效率成为近来研究者们的常用选择。与其他逆转录病毒载体相比,慢病毒载体主要有以下几个优点:其一:慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞,又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞,包括造血干细胞,神经干细胞,处于分化终末的神经元,肝实质细胞等;其二:由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力,在体外培养细胞实验和体内移植实验中,由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达;其三:慢病毒载体可以兼容多个转录启动子,包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子;其四:经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因,因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具。

张鹏辉等利用DNA载体一RNAi技术,构建了重组表达质粒PTZU6+l一shRNA一hTERT,

并成功导人肝癌细胞株SMMC一7721及裸鼠皮下移植瘤,发现siRNA诱导的RNAi明显抑制hTERT基因的表达及肝癌细胞增殖,逆转肝癌细胞的恶性表型。端粒酶由核酸和蛋白质构成,是位于真核细胞染色体末端的l种以RNA为模版的DNA聚合酶,能以自身RNA组分为

模板从头合成端粒,具有延长端粒的作用,以弥补细胞分裂时染色体末端的缩短,解决“末端复制问题”。端粒酶(telomerase)的异常表达与恶性肿瘤的发生、发展、预后密切相关。而其

催化亚基hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,在肝癌中的表达阳性率约为89.5%。封闭或下调hTERT表达能引起端粒缩短,破坏染色体稳定性而抑制细胞生长并促进细胞凋亡,

逆转肿瘤细胞恶性表型。丁朝建等侧研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌SMCC一7721细胞的作用,发现hTERT反义RNA转人SMCc一7721细胞后,细胞生长速度明显变慢,其凋亡率明显高于sMCc一7721细胞和转染peDNA3.1空载体的sMcc一7721细胞。刘利等野U用反义端粒酶RNA真核表达栽体导人人髓性白血病细胞系HL一60中,发现端粒酶反义RNA能显著抑制HL~60细胞的端粒酶活性,抑制HL一60细胞的增殖并谤导其凋亡。张等采用脂质体介导法将端粒酶反义RNA真核表达载体(pBBS21ZhTR)导人人肾癌GRC一1细胞系中,电镜下观察到细胞增殖速度变慢而凋亡速度却加快,表明端粒酶反义RNA能显著抑制细胞的端粒酶活性,抑制细胞增殖并促进其凋亡。Survivin是一种凋亡抑制因子,Williams等利用RNAi在一个结肠癌细胞系HCTll6阻断survivin表达,结果在动物模型体内及体外细胞系均明显抑制肿瘤的生长。肿瘤生长具有血管依赖性,因此抑制血管形成可

治疗肿瘤。多耐药基因(MDRI)编码的R糖蛋白在多药耐药性中发挥重要作用。Stege等固

用RNAi技术完全抑制了MDRlmRNA及其蛋白水平的表达,有效逆转了胃癌细胞的耐药。

研究表明RNAi技术介导的MDRI基因抑制对由该基因引起的耐药肿瘤是一前景光明的治疗方法,RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在多基因调控的肿瘤治疗领域取得了

迅速的发展。

RNA 干扰是指由双链 RNA 诱发的基因沉默，是生物进化中一项保守的防御机制。现在 RNA 干扰主要作为一种研究手段，被用于特异性抑制基因的表达。RNA 干扰机制研究表明，双链RNA 分子首先被细胞内 RNA 酶 Dicer 降解成 21~23 个碱基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)。siRNA 结合一个核酶复合物形成RNA 诱导沉默复合物

(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC通过碱基配对定位到有同源序列的 mRNA 上，并在特定位置切割该 m R N A，从而抑制该同源基因的表达。siRNA 被认为是 RNA 干扰的主要效应物。直接转染合成的 siRNA能特异性抑制哺乳动物细胞内同源基因的表达，但细

胞内 siRNA 很容易被降解。因此这种方法不能实现稳定的 RNA 干扰。相比之下，质粒载体或病毒载体就能在细胞内长时间、稳定地生成siRNA。但质粒载体转染哺乳动物细胞的效

率不如病毒载体，尤其无法转染非分裂相细胞。慢病毒载体是常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达 siRNA，长期抑制基因表达。

基因治疗的方法多种多样并在迅猛发展中。

参考文献：

1.慢病毒载体的设计及应用进展

2.RNA干扰机制及其应用研究进展

3.RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

4.纳米生物技术基因治疗载体研究进展

5.慢病毒载体介导的 RNA 干扰

6.等等