基因工程药物研发过程

目的基因的获得：

将生产干扰素的白细胞的mRNA分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母细胞，并测定合成干扰素的抗病毒活性，结果发现12SmRNA的活性最高，因此用这部分mRNA 合成cDNA。

将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化大肠杆菌K12，的几千个重组子克隆，每个克隆都用粗提的干扰素的mRNA去进行杂交。

把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行翻译，对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活性检测，经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA。

最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达。产物的提取和纯化

▪把发酵产物4000r/min离心30min,弃上清得1000g左右

▪取100g湿菌体重新悬浮于500ml,20mmol/L磷酸缓冲液中（pH7.0）,冰浴,超声波破碎,离心取沉淀。

▪尿素、磷酸缓冲液、二巯基苏糖醇室温搅拌抽提2小时。

▪离心取上清，磷酸缓冲液（pH7.0）稀释尿素浓度为0.5mmol/L，加二巯基苏糖醇至

0.1mmol/L，4℃搅拌，15小时，离心除去不溶物。

▪上清液经中空纤维超滤器浓缩

▪将浓缩的人干扰素α2b溶液经过Sephadex D50 分离，收集人干扰素α2b部分，经SDS-PAGE检查。

▪将Sephadex D50柱分离的人干扰素α2b组分，再经DE-52柱（2厘米*50厘米）纯化人干扰素α2b组分，，收集含人干扰素α2b的洗脱液。

▪全过程蛋白回收率为20-25%，产品不含杂蛋白，DNA及热源含量合格。

、半成品检定

（1）效价测定

用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。

（2）蛋白质含量测定

福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。

（3）比活性

效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。

（4）纯度

电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。

（5）相对分子量测定

还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。

（6）残余外源性DNA含量测定

用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。（7）残余血清IgG含量测定

在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。

（8）残余抗生素活性测定

半成品中不应有抗生素活性存在。

（9）紫外光谱扫描

检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳米。

（10）肽图测定

用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。

（11）等电点测定

等电聚焦电泳。

（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。

1）物理性状

冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。

（2）鉴别试验

应用ELISA或中和试验检定。

（3）水分测定

用卡氏法，应低于3%。

（4）无菌试验

同半成品。

（5）热原质试验

同半成品检定。

（6）干扰素效价测定

同半成品检定，效价不应低于标示量。

（7）安全试验

取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。

取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。