柠檬酸的制备及发展

乙二酸摘要：本人介绍了丁二醇的性质，生产方法，应用及未来发展。

对甘蔗糖蜜作为廉价碳源厌氧发酵制备丁二酸进行初步研究，丁二酸是一种重要的化工原料，广泛用于食品、医药和化工等行业，市场前景广阔。

微生物发酵法生产丁二酸具有高效、环保、可持续利用的特点，是一种新型的绿色化工生产工艺。

详细介绍了丁二酸发酵法生产技术及研究进展, 并对其应用前景进行了展望。

关键词：丁二酸，糖蜜，发酵丁二酸概念丁二酸俗称琥珀酸，是一种二羧酸，能发生二元酸的大多数典型反应，由于分子中含有两个活泼的亚甲基，因此又具有许多其他的重要反应特性，如卤化、酯化、碘化等等，是合成各种复杂有机物的中间体，也是制造药物的重要原料。

丁二酸的性质纯净丁二酸为无色晶体，无嗅、有酸味、可燃，是一种二羧基四碳酸（图1），是三羧酸循环和厌氧发酵的中间代谢物，部分微生物能量代谢的终产物可产生琥珀酸盐。

天然品主要存在于海藻、地衣和真菌中。

琥珀酸作为四碳饱和二羧酸，可衍生转化为四氢呋喃、1,4-丁二醇、γ丁内酯、马来酸和反丁烯二酸等衍生物化学制品。

丁二酸应用在食品行业，琥珀酸作为酸味剂、调味剂用于饮料与糖类食品，其钠盐可改善豆酱、酱油等佐料的口味[1]。

琥珀酸是影响啤酒口味的重要有机酸，还可用作奶类制品的铁强化剂以及新型乳化剂[2]，促进生长发育。

用于咸菜、火腿、香肠、鱼加工产品、肉罐头等的风味改良剂，在医药行业，琥珀酸用于合成镇静剂、pH 调节剂、避孕药、抗癌药物、抗生素及维生素等。

维生素E琥珀酸酯（α-生育酚琥珀酸酯）能抑制人类乳腺、子宫内膜、前列腺和淋巴等组织肿瘤的生长，对正常细胞无影响[3]。

在化学工业，琥珀酸用于生产染料、树脂、工程塑料、酯类和农药等；电镀用的pH调节剂和助焊剂，锡膏的助焊酸；合成除锈剂、去垢剂，铝、锌的刻蚀剂；还可用于润滑剂、添加剂及弹性体纺织品中，在表面活性剂领域的应用尤为广泛。

在农业方面，丁二酸是一种植物生长激素，它能控制植物生长、调节养分、增加抗旱、抗病、抗冻能力，施用于农作物一般能增产10%-20%，还用来处理大麦黑穗病，用作除草剂的添加剂。

促进种子发芽抗病毒。

在动物瘤胃中作为缓冲剂和动物能量的来源。

丁二酸衍生物是一种良好的表面活性剂，是去垢剂、肥皂和破乳剂的组分；丁二酸可生产脱毛剂、牙膏、清洗剂、高效去皱美容酯。

丁二酸还用于燃料、润滑剂、添加剂、弹性体中。

丁二酸对化学镀镍有加速和稳定作用。

丁二酸还是合成可降解聚酯PBS的重要原料，每吨PBS消耗原料丁二酸0.62吨。

预计未来我国对PBS的需求为300万吨/年，丁二酸市场需求204万吨/年，目前国内丁二酸的产能不足5万吨，满足不了市场需求，每年都需要进口丁二酸；有限的丁二酸产能成为PBS产业发展的瓶颈。

丁二酸的生产方法及菌种目前利用廉价废弃生物质作为碳源发酵生产丁二酸成为研究热点，木质纤维素原料如秸秆[6]、玉米芯[7]、甘蔗渣[8]等经过处理后得到的水解液中含有大量可发酵糖如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。

利用水解液作为生产丁二酸的原料，能够降低生产成本并减少废弃生物质对环境造成的污染。

制糖工业中主要的副产物甘蔗糖蜜，与秸秆等木质纤维素原料相比，不需要进行预处理即含有大量的可发酵糖，其中绝大多数为蔗糖，同时含有无机盐、维生素等成分，可提供微生物生长代谢所需的营养物质，是十分具有潜力的廉价生物质资源[9-10]琥珀酸的生产方法有化学合成法和发酵法。

化学合成法主要有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等。

丁二酸的生产方法有化学合成法、生物法（生物转化法和发酵法）、电解法。

目前国内生产该产品的厂家有：江苏省丹阳市仙桥涂料有限公司、安庆和兴化工有限责任公司、陕西宝鸡宝玉化工有限公司、陕西渭南惠丰化工有限公司、安徽三信化工有限公司、安庆和兴化工有限责任公司、常州曙光化工厂等，除了陕西宝鸡宝玉化工有限公司和陕西渭南惠丰化工有限公司使用顺酐加氢法外，其他厂家几乎都使用电解法。

4、氯乙酸甲酯的氯化水解法工艺流程目前氯乙酸甲酯售价为7500元/吨左右，理想状态下2mol氯乙酸甲酯生成1mol丁二酸，核算单原料氯乙酸甲酯的成本在14000元左右，成本较高，此法不适合工业化生产丁二酸。

6、电化学还原法电解法以顺酐为原料电解还原制备丁二酸，经过近80年的发展，电解合成技术和工艺较成熟，电解收率、电流效率和转化率较高，能制得高纯度的丁二酸，同时通过母液循环套用技术实现了废水的零排放，是一种真正的绿色化学合成技术。

基本原理如下：首先是顺酐先水解成顺丁烯二酸：然后顺丁烯二酸被电解还原成丁二酸：目前，已开发出隔膜法、无隔膜法和成对电合成等多种合成丁二酸的电化学技术。

早期人们为了防止阴极生成的丁二酸扩散到阳极进一步氧化而影响电流效率和电解收率，一般使用隔膜将阴、阳两级分开，在实际中发现这些隔膜存在许多缺点，如选择性和导电性差，易碎、安装困难、进口膜价格昂贵等，导致了电解生产丁二酸时能耗高，操作强度大，限制了其发展；后来人们研究发现阴极生成的丁二酸扩散到阳极进一步氧化而影响电流效率和电解收率，因此发展了无隔膜电解生产丁二酸的技术，无隔膜电解法使设备结构简化，大大减少投资，同时还简化了操作，维修工作量小。

7、发酵法所谓的发酵法产丁二酸就是利用细菌或其他微生物发酵的方法以淀粉、糖或其他微生物能够利用的废料生产琥珀酸及其衍生物的方法。

此法存在成本较高、产生废水较多等缺点，需进一步完善。

目前世界范围内只有美国应用碳化学公司、法国roquette公司与帝斯曼公司采用发酵法生产丁二酸，主要是供食品工业用。

表1 化学法和发酵法生产丁二酸工艺对比发酵法是利用细菌及其它微生物以淀粉、糖或其它原料为底物生产琥珀酸及其衍生物。

产琥珀酸菌的种类繁多，目前研究较多的有：产琥珀酸放线杆菌[4]，产琥珀酸厌氧螺菌[4]、Mannheinia succiniciproducens[4,5]（曼海姆产琥珀酸菌）和Escherichia coli（大肠杆菌）[4,6,7]。

此外，有产琥珀酸的霉菌[8]和乳酸菌。

纸色谱、高效液相色谱法（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPCE）是检测是否筛选到产琥珀酸菌株及产量高低的常用方法产琥珀酸菌株的代谢途径决定了琥珀酸的产量。

产琥珀酸放线杆菌对高浓度葡萄糖有较好的耐受性，这对发酵十分有利，其代谢途径见下图；图大肠杆菌产琥珀酸量较低。

研究发现不同糖类的产酸量不同，用葡萄糖做底物时最高。

Stols 等[25]发现，在大肠杆菌突变株NZNlll中表达NAD+依赖的大肠杆菌苹果酸酶后再用于琥珀酸发酵，使琥珀酸产量从0.65 g/g 葡萄糖升到1.2 g/g葡萄糖。

Lee等[21]向培养基添加一定比例的甘油，使琥珀酸产率达到160 %，且琥珀酸与乙酸之比为31.7:1，提高了琥珀酸的纯度。

此后用玉米提取物取代酵母提取物作氮源，得到每g 葡萄糖0.89 g 的产量，与用酵母提取物的结果一样[26]。

发酵机理丁二酸的发酵工艺是典型的厌氧发酵，二氧化碳在发酵菌株的代谢过程中起着非常重要的作用。

发酵固碳机理见图1。

丁二酸的产生途径主要为两条：（1）葡萄糖转化成磷酸烯醇式丙酮酸，由于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是一种固定CO2的酶，在CO2存在的情况下，该酶将磷酸烯醇式丙酮酸催化生成草酰乙酸，然后被后续的其他酶转化为苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。

此途径是丁二酸的主要生成途径。

（2）葡萄糖生成磷酸烯醇式丙酮酸后，在丙酮酸激酶的作用下转化为丙酮酸，由于人为阻断了丙酮酸转化为乳酸、乙醇和乙酸等产物的代谢途径，大量积累的丙酮酸在苹果酸酶的作用下转化为苹果酸后，再转化为富马酸，最终生成丁二酸。

通过以上两条途径，生产菌株将葡萄糖最终全部代谢转化为丁二酸。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是产生丁二酸的主要生化反应的关键酶和限速酶，它受CO2浓度的影响和调控较为突出，较高的CO2浓度可以提高磷酸烯醇式丙酮酸的活性，有利于厌氧环境的维持和丁二酸的产生。

有研究表明，二氧化碳和葡萄糖的摩尔比为1∶1时，葡萄糖发酵液以丁二酸为主要产物[20]。

因此当前对发酵工艺的研究主要集中于使发酵菌株在代谢过程中最大限度地利用二氧化碳。

研究者大多采用连续不断地通入CO2的方法，提供厌氧发酵的环境，保证菌株固碳效果。

同时，在培养液中加入少量的营养物质和金属盐，可以提高菌株的生产速率和丁二酸的产率。

如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在Mn2+、Co2+、Mg2+影响下能表现出最大的活性[21]，可以有效促进丁二酸的生成。

丁二酸的最佳发酵过程在中性条件下进行。

由于酸的产生会降低pH值，不利于菌株的生长，导致碳源的利用率下降，因此需通过加碱来调节pH值。

如DATTA R等[22]添加氢氧化钙调节发酵液的pH值，在发酵过程中同时结晶出丁二酸钙；梁丽亚等[23]通过5 mol/L NaOH外源流加调节发酵液的pH值至7.0；谢鑫等[24]和白雪飞等[25]通过加入MgCO3来控制发酵过程中的pH值。

在实际生产中，Na2CO3、MgCO3等强碱弱酸盐中和发酵液有以下优点：CO32-水解反应后既可以提供OH-，调节发酵液的pH值；水解出的CO2又可以为菌株的发酵过程提供碳源。

为节约成本，寻找可再生的廉价底物也是一种趋势。

利用玉米秸秆水解液、甘蔗糖蜜和酶水解菊芋糖浆作为底物也可以生产琥珀酸。

8、生物转化法生物转化法是利用菌株产生的富马酸还原酶将富马酸（反丁烯二酸）转化为丁二酸，转化率达95%（或99%）。

由于使用了大量的底物富马酸，目前化学法生产富马酸的主要原料也是化学原料顺丁烯二酸酐，所以其生产的经济性还有待深入研究。

目前只有日本的三井化学采用此法生产丁二酸。

提取工艺要想得到一种经济上可行的丁二酸发酵, 分离工艺路线短、成本低的提取工艺是极为关键的。

由于在丁二酸的发酵过程中通常需要用碱调节pH , 发酵产物是有机酸盐;另外, 发酵罐中的不溶性物质(例如死细胞、蛋白等)需要从最终产品中除去。

因此,典型的下游过程包括除去细胞和蛋白一类的杂质,浓缩,将丁二酸盐转化为游离的丁二酸, 将游离的丁二酸提高到所需的浓度等过程。

过去产品提取、浓缩、酸化、纯化过程中效率不高,使得以发酵为基础的生产工艺不能实现。

但是通过对工艺的不断进并结合一些最近的新技术,发酵法从碳水化合物生产以丁二酸为基础的化学制品,并将其从它的稀发酵液中提取和纯化成为现实,并且该方法在经济上极具吸引力[ 3] 。

从发酵液中提取有机酸的经典方法是液-液萃取,这在化学工业中是一种效果良好、应用广泛的方法[ 28] 。

姚虎卿等[ 29] 以磷酸三丁酯(TBP)、三烷基胺(7301)为络合剂,分别采用甲苯、异丙基甲酮、正辛醇、煤油作为稀释剂对丁二酸稀溶液进行络合萃取,结果表明,混合型络合剂对丁二酸稀溶液进行萃取,可取得满意的分离效果。