第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础
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• 有些特定的限制位点，只有当其它的限制位点被广泛切割时， 才能被有关的核酸限制性内切酶消化
• 少数酶，如SacII对不同部位的限制位点的切割活性会有很 大的差异，其中有些位点很难被切割
核酸限制性内切酶的缓冲液
• 核酸内切酶的标准缓冲液组分： • MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巯基乙醇或
• hsd R---限制性内切酶:能识别DNA分子 上的特定位点并将双链DNA切断
• hsd M---限制性甲基化酶 :催化DNA分子 特定位点上的碱基甲基化反应
• hsd S---控制两个系统的表达 :协助上述 两种酶识别特殊的作用位点
• 宿主细胞内的甲基化酶将自身DNA和噬 菌体DNA实施特异性保护，封闭了自身 限制性酶的识别位点
如Hind II
（1）识别位点
未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中 心对称的回文结构，由4-8个碱基组成， 有些识别位点是连续的，有些则是间断的 ，如GANTC
3'
C-A-Pu-Biblioteka Baiduy-T-G
5'
5'
G-T-Py-Pu-A-C
3'
（2）切割位点
绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA
EcoRⅠ
5′ GAATTC 3′ 3′ CTTAAG 5′
a 限制（Restriction）
• 限制性内切酶将侵入细菌体内的外 源DNA分子进行分解，切成小片段
A
A
B
B
B
B
B
b 修饰（Modification）
• 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化 修饰保护，不能被自身的限制性内切酶 识别切割
c 限制修饰系统分子机理
• 由三个连续基因位点所控制： hsd R, hsdM, hsd S
• 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结 合形成的位点，称之为“杂种位点 ”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构， 一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别
影响限制性内切酶活性的因素
• 1、DNA的纯度 • 2、DNA的甲基化程度 • 3、酶切反应的温度 • 4、DNA的分子结构 • 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液
粘性末端
5′ G 3′ CTTAA
AATTC 3′ G 5′
SmaⅠ
5′ CCCGGG 3′ 3′ GGGCCC 5′
平头末端
5′ CCC 3′ GGG
GGG 3′ CCC 5′
• 粘性末端 （cohensive end） 连接便利
DNA 分子末端标记 平末端补齐
一把特殊的剪刀
—限制性内切酶的发现
如EcoRI等,在正常条件下，切割5`GAATTC3`， 但在甘油浓度>5%时,也可切割 5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`
限制性内切酶反应的终止
• 终止后直接电泳检测酶切结果
完全消化和部分消化
• 完全消化
• 消化反应温度高于或低于最适反应温度， 都会影响酶的活性
• 每ugDNA 用1-5U酶切1-2h
DNA的分子结构
• 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的 酶量比消化线性DNA高出20倍
• 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有 明显的差异， 可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造成 的
• 这种限制不完全，总有少数入侵DNA会 存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿 主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了 原宿主甲基化酶标记
d 意义
• 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过 程，广泛存在于原核细菌中。有两方面 作用：
• 保护自身DNA不受限制 • 破坏外源DNA，使之迅速降解
二 限制性内切酶的命名
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同， 识别的是同样的核苷酸靶序列
• 同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的 靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端
由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间 的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处
DNA的纯度
DNA的甲基化程度
• 原核生物限制—修饰体系，对识别序列中特定核苷酸 的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的 是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时应注意：
• 所选用的限制酶对甲基化的敏感性 • 依DNA的不同来源选择不同的限制酶
反应温度
• 大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度 为37 ℃ ，但也有许多例外，如SmaI为25 ℃ ，ApaI为30 ℃ ，TaqI为65 ℃
第二章 基因工程的酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
限制性核酸内切酶
• 是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此 切割DNA双链结构的核酸内切酶
1、来源及发现 • 主要来源于原核生物 • 1968 年 ， Dr. Werner Arber, Dr. Daniel
Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从 大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 • 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶
Dr. Werner Arber
2性质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
3功能
自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
• 命名：
– EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：酶 编码基因所在质粒；Ⅰ：发现次序)
三 限制性内切酶类型
• 目前鉴定出3种不同的限制性内切酶
• I 型限制性内切酶 • II型限制性内切酶 • Ⅲ型限制性内切酶
限制性内切酶的类型及其主要特性
II型限制性内切酶的基本特性
• 1970年，由H. O. smith和K. W. wilcox 从 流感嗜血菌中分离得到
DTT以及BSA等 • NaCl或Mg2＋浓度：降低酶的活性，导致识别
序列特异性改变 • Tris-HCl:稳定反应液的pH在酶的最佳pH范围
内 • 巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活 • Na、K离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适
应较广的离子强度的变化幅度
酶解反应中的星号活性
• 星号活性（star activity）当酶反应体系发生改 变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象
• 少数酶，如SacII对不同部位的限制位点的切割活性会有很 大的差异，其中有些位点很难被切割
核酸限制性内切酶的缓冲液
• 核酸内切酶的标准缓冲液组分： • MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巯基乙醇或
• hsd R---限制性内切酶:能识别DNA分子 上的特定位点并将双链DNA切断
• hsd M---限制性甲基化酶 :催化DNA分子 特定位点上的碱基甲基化反应
• hsd S---控制两个系统的表达 :协助上述 两种酶识别特殊的作用位点
• 宿主细胞内的甲基化酶将自身DNA和噬 菌体DNA实施特异性保护，封闭了自身 限制性酶的识别位点
如Hind II
（1）识别位点
未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中 心对称的回文结构，由4-8个碱基组成， 有些识别位点是连续的，有些则是间断的 ，如GANTC
3'
C-A-Pu-Biblioteka Baiduy-T-G
5'
5'
G-T-Py-Pu-A-C
3'
（2）切割位点
绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA
EcoRⅠ
5′ GAATTC 3′ 3′ CTTAAG 5′
a 限制（Restriction）
• 限制性内切酶将侵入细菌体内的外 源DNA分子进行分解，切成小片段
A
A
B
B
B
B
B
b 修饰（Modification）
• 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化 修饰保护，不能被自身的限制性内切酶 识别切割
c 限制修饰系统分子机理
• 由三个连续基因位点所控制： hsd R, hsdM, hsd S
• 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结 合形成的位点，称之为“杂种位点 ”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构， 一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别
影响限制性内切酶活性的因素
• 1、DNA的纯度 • 2、DNA的甲基化程度 • 3、酶切反应的温度 • 4、DNA的分子结构 • 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液
粘性末端
5′ G 3′ CTTAA
AATTC 3′ G 5′
SmaⅠ
5′ CCCGGG 3′ 3′ GGGCCC 5′
平头末端
5′ CCC 3′ GGG
GGG 3′ CCC 5′
• 粘性末端 （cohensive end） 连接便利
DNA 分子末端标记 平末端补齐
一把特殊的剪刀
—限制性内切酶的发现
如EcoRI等,在正常条件下，切割5`GAATTC3`， 但在甘油浓度>5%时,也可切割 5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`
限制性内切酶反应的终止
• 终止后直接电泳检测酶切结果
完全消化和部分消化
• 完全消化
• 消化反应温度高于或低于最适反应温度， 都会影响酶的活性
• 每ugDNA 用1-5U酶切1-2h
DNA的分子结构
• 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的 酶量比消化线性DNA高出20倍
• 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有 明显的差异， 可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造成 的
• 这种限制不完全，总有少数入侵DNA会 存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿 主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了 原宿主甲基化酶标记
d 意义
• 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过 程，广泛存在于原核细菌中。有两方面 作用：
• 保护自身DNA不受限制 • 破坏外源DNA，使之迅速降解
二 限制性内切酶的命名
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同， 识别的是同样的核苷酸靶序列
• 同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的 靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端
由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间 的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处
DNA的纯度
DNA的甲基化程度
• 原核生物限制—修饰体系，对识别序列中特定核苷酸 的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的 是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时应注意：
• 所选用的限制酶对甲基化的敏感性 • 依DNA的不同来源选择不同的限制酶
反应温度
• 大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度 为37 ℃ ，但也有许多例外，如SmaI为25 ℃ ，ApaI为30 ℃ ，TaqI为65 ℃
第二章 基因工程的酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
限制性核酸内切酶
• 是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此 切割DNA双链结构的核酸内切酶
1、来源及发现 • 主要来源于原核生物 • 1968 年 ， Dr. Werner Arber, Dr. Daniel
Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从 大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 • 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶
Dr. Werner Arber
2性质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
3功能
自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
• 命名：
– EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：酶 编码基因所在质粒；Ⅰ：发现次序)
三 限制性内切酶类型
• 目前鉴定出3种不同的限制性内切酶
• I 型限制性内切酶 • II型限制性内切酶 • Ⅲ型限制性内切酶
限制性内切酶的类型及其主要特性
II型限制性内切酶的基本特性
• 1970年，由H. O. smith和K. W. wilcox 从 流感嗜血菌中分离得到
DTT以及BSA等 • NaCl或Mg2＋浓度：降低酶的活性，导致识别
序列特异性改变 • Tris-HCl:稳定反应液的pH在酶的最佳pH范围
内 • 巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活 • Na、K离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适
应较广的离子强度的变化幅度
酶解反应中的星号活性
• 星号活性（star activity）当酶反应体系发生改 变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象