卡那霉素在植物转基因中的应用及

卡那霉素在植物转基因中的应用及
其抗性基因的生物安全性评价
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王紫萱　易自力
33
(湖南农业大学细胞工程重点实验室　长沙　410128)
摘要　介绍了卡那霉素在转基因植物筛选中的作用机理及其在植物转化过程和转化后代中的应
用现状。

卡那霉素不仅在植物转化过程中可起到筛选作用,而且在转化后代中可通过其对后代进行遗传分析和测定种子纯度,同时还可用于后代田间成株的筛选。

随着卡那霉素的广泛使用,卡那霉素抗性基因的安全性问题日益受到重视。

概述了转基因植物的杂草化、卡那霉素抗性基因的水平扩散、抗生素医疗安全性和食用安全性等方面的研究进展。

关键词　卡那霉素　转基因植物　生物安全性收稿日期:2002212226　修回日期:20032032103863基金项目资助(101201201201)
33通讯作者,电子信箱:yzlzj @public.cs.hn.g ov
转基因植物中的外源基因主要有两大类,即目的基因和标记基因。

标记基因是帮助对转基因生物工程体进行筛选和鉴定的一类外源基因,它包括
选择标记基因和报告基因[1]。

在选择压力下,不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡,而转化细胞由于有抗性,可以继续存活,因而有利于从
大量的非转化细胞和组织中选择出转化克隆[1,2]。

目前,在植物转基因中使用的筛选剂主要有抗生素类,除草剂类,氨甲喋呤,氨基酸类。

在抗生素类中,主要有卡那霉素(kanamycin ,K an )、潮霉素(hygromycin ,Hyg ),庆大霉素衍生物(geneticin ,G 418)等,其中卡那霉素在植物的遗传转化中是应用最早最广泛的一种筛选剂。

因此其筛选效果和抗性基因的生物安全性问题受到了人们的普遍关注。

1　卡那霉素的作用机理
卡那霉素是目前植物基因工程中被广泛应用
的选择标记。

选择标记的功能是在选择压力下把转化体选择出来。

为达到这一目的,首先要在选择培养基或选择溶液中加入筛选剂,产生一种选择压力,使未转化细胞不能生长;其次是选择标记基因的产物对筛选剂产生抗性使转化细胞不受筛选剂
的影响,能正常生长、发育、分化,从而把转化体筛选出来。

卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。

卡那霉素抗性
(K an r
)基因即新霉素磷酸转移酶基因(npt 2Ⅱ),亦可称为氨基糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因(aph 2Ⅱ
),它来自大肠杆菌(E .coli )的aphA 2基因。

是目前在植物基因
转化中应用最广泛的选择标记基因。

它编码的产物
氨基糖苷磷酸转移酶(APH (3′)Ⅱ—酶)能对氨基糖苷类抗生素———卡那霉素具有抗性
[3]。

此酶最早是从
细菌转座子T n5中分离得到的,它的作用原理是:
npt 2Ⅱ基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生
素失效,从而解除毒性。

因为卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成,引起植物绿色器官的黄化,最终导致植物细胞的死亡。

而转
基因植物由于含有卡那霉素抗性(npt 2Ⅱ
)基因而抑制了卡那霉素的作用,所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。

2　卡那霉素在植物转基因中的应用
2.1　卡那霉素在植物转化过程中的筛选作用
在植物的遗传转化过程中,由于转化体很少,所以必须进行筛选,卡那霉素作为一种筛选剂常常加入选择培养基中对转化体进行筛选。

但卡那霉素毒性不能太高,因为当卡那霉素对未转化细胞有强毒害时,细胞将快速死亡,死亡或将要死亡的细
第23卷第6期
中　国　生　物　工　程　杂　志
CHI NA BI OTECH NO LOGY
2003年6月
胞对邻近的细胞将产生抑制作用,不利于转化细胞生长[3]。

因为不同植物的不同外植体对卡那霉素的敏感性不一样,所以筛选浓度也不一样,因此在转化之前,应对卡那霉素设置一系列的浓度梯度,找出植物对卡那霉素的敏感性浓度,以便在这个适当的条件下,非转化细胞的生长能有效地抑制,缓慢死亡。

一般说来,单子叶植物对卡那霉素的敏感程度较双子叶弱,因此在筛选过程中,单子叶植物的筛选浓度要较双子叶高。

比如说水稻,在遗传转化过程中卡那霉素对水稻愈伤组织的筛选浓度达到了500mgΠL,由于卡那霉素毒性太高会对转化细胞造成伤害,所以卡那霉素一般在单子叶植物中应用较少,而双子叶植物中要相对较多。

Cho等[4]研究大豆毛根的实验中,以大豆的子叶做外植体,与带有二元载体的农杆菌K599共培养,用含200mgΠL 卡那霉素的培养基诱导筛选,产生了大量抗卡那霉素的毛根。

林久生等[5]用农杆菌介导法转化马铃薯,用含卡那霉素75mgΠL的选择培养基筛选,获得了卡那霉素抗性苗。

程英豪等[6]也用相同的方法转化番茄,以含卡那霉素100mgΠL的培养基筛选,获得了抗卡那霉素的转基因番茄植株。

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用来清除转化后多余农杆菌的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率。

彭日荷等[7]构建了用插入内含子的卡那霉素抗性基因(npt2Ⅱ)作为抗性选择标记的双元载体,以此来转化烟草,在筛选培养基中加入卡那霉素后,农杆菌不能生长,转基因外植体能正常地分裂和分化,因此利用卡那霉素能起到抗性芽筛选和农杆菌清除的目的。

利用这种方法,对于一些再生频率较低的植物能明显的起到提高再生频率的作用。

在植物转化过程中,应用卡那霉素筛选抗性株虽然普遍,但筛选都不是很彻底,抗性株中有时还存在着一些假阳性株[8,9],特别是当筛选培养基中存在葡萄糖时[10],筛选结果更难肯定。

所以一般都要在继代、分化和成苗过程中进行再次筛选,必要时还要对转化株进行分子检测,以确保筛选结果的可靠。

2.2　卡那霉素在转基因植株后代中的应用
2.2.1　对转基因植物后代进行遗传分析　用卡那霉素对转基因植株后代进行筛选,观察其性状分离现象,可以分析外源基因的遗传特点。

林良斌等[11]将转基因代(T0代)抗性种子在含卡那霉素的培养基中萌发,后代(T1代)植株有性状分离现象,卡那霉素抗性株与敏感株的分离比约为3∶1,由此说明外源基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株的基因组中。

相似地,商鸿生等[12]将转基因线辣椒的T2代纯合系自交,得到T22T4代种子,同时将T2代植株与转化株杂交得F1、F2代种子,将这些种子在含卡那霉素300mgΠL的培养基上萌发,结果表明,抗卡那霉素标记基因在自交和杂交各代都能稳定地高效表达,且在自交各代纯合,卡那霉素标记基因为显性单基因遗传。

Dubreucq等[13]在鉴定和分离决定拟南芥种子萌发的基因的实验中,将拟南芥转化株自交至T4代,用卡那霉素作筛选后代种子,未萌发者为卡那霉素敏感株,以此来研究决定种子萌发的基因的特性等等。

2.2.2　鉴定转基因后代种子纯度　让转基因后代种子在含卡那霉素的培养基上发芽,观察子叶或幼苗变化情况,以鉴定种子的纯度。

Lee等[14]用卡那霉素营养液大量筛选转基因水稻种子,效果明显,不抗的植株或生长受到限制,或叶片白化死亡,且可在有菌条件下大量筛选。

这是筛选转基因后代种子的最早期报道。

现在也有相关的研究说明:郝文媛等[15]将玉米种子接种在一定浓度的卡那霉素培养基上萌发,凡对卡那霉素有抗性的种子长成的幼苗表现为正常绿色,而不具备抗性的种子表现为缺绿或白化。

同样地,王丕武等[16]也发现卡那霉素能明显抑制大豆幼苗的生长,在300mgΠL浓度下,大豆幼苗主根明显减短,且无侧根长出。

这在鉴定转化后代中是一种很容易鉴别的指示性状。

孙敬等[17]将转Bt基因棉花种子消毒培养至露白,然后接种在含卡那霉素的培养基中,根据子叶颜色变化情况也筛选出了抗性株。

这样,通过对转基因植物的后代进行的有效筛选,就保证了转基因后代的遗传稳定和纯度,这可进一步促进转基因植物产品的商品化生产。

2.2.3　卡那霉素对转基因成株的筛选　卡那霉素对转基因成株的筛选作为一种新型的鉴定转基因成株的方法,与通过卡那霉素培养基培养植株苗在室内筛选相比,此方法快速、简单。

适用于生产上的大面积使用。

徐子勤[18]用2.5%的硫酸卡那霉素水溶液喷洒转基因小麦再生植株,非转化体完全白化并枯萎,由此获得了抗卡那霉素的转基因再生
01中　国　生　物　工　程　杂　志第23卷
小麦。

马丽华等[19]也用硫酸卡那霉素药液涂抹田间棉花叶片快速地鉴别出了转Bt基因抗虫棉。

笔者在研究中是采用剪取田间叶片在有菌条件下用750mgΠL的卡那霉素营养液对离体叶片进行培养,5天后,效果明显,敏感株黄褐化、枯死,而抗性株叶片没有明显变化。

此方法可适用于水稻整个大田生长时期。

虽然此方法在其它作物中少见其相关报道,但此方法效果好、实用性强,值得推广。

3　转基因植物中卡那霉素抗性基因的生物安全性
在转基因技术蓬勃发展、转基因植物大量涌现的同时,转基因抗生素抗性基因的安全性问题在国际上引起了广泛的争论,卡那霉素抗性基因作为应用最为广泛的一种抗生素抗性基因更是如此。

人们担心:转基因植物释放后会不会变成不可控制的杂草?卡那霉素抗性基因会不会水平扩散?卡那霉素抗性会不会使抗生素失去医药价值?转基因食品有没有食用不安全性?
3.1　转基因植物的杂草化
含卡那霉素抗性标记基因的转基因植物是否会转化为不可控制的杂草主要取决于自然界中存在的卡那霉素抗性基因的浓度是否高到使转基因植物中的卡那霉素抗性基因的选择优势得以体现[1]。

土壤中卡那霉素的来源主要有两个方面,一是某些土壤微生物产生,二是兽用卡那霉素在土壤中的积累。

据测定,土壤微生物产生卡那霉素的数量甚微,靠它们形成选择压是不可能的。

兽用卡那霉素在土壤中积累能否形成选择压?以兽牧业比较发达的荷兰为例,每年卡那霉素在5cm原表土中的残留量是0113μgΠml地下水。

即使不考虑生物降解作用,也需要5000多年才积累到形成选择压所需的水平[1]。

卡那霉素的生物物理特征表明:在实验室外,抗生素的钝化将会阻碍选择性浓度在土壤中的建立,这种钝化是由于土壤的结构成分吸收了抗生素所致,此外,这些抗生素还会被降解,在没有选择的情况下,卡那霉素抗性没有特殊的优势[20]。

因此,不论是转基因植物本身,还是通过杂交授粉可以获得该基因的近亲,都不会变得比未转化的亲本更为杂草化。

3.2　卡那霉素抗性基因的水平扩散
基因水平扩散的主要途径是通过花粉、种子来实现的,但这种扩散要受到诸多限制:与相关野生种的亲缘关系,发生杂交的适合性,花粉授粉方式、种子扩散模式等[21]。

不同植物与其相应野生种发生杂交的机会不同,发生扩散的概率的大小不同。

像棉花、小麦、番茄等植物发生基因扩散的风险几乎为零。

不过即使转基因植物中卡那霉素抗性基因转移到近缘野生种,由于自然条件下无法形成相应的选择压。

因此,野生种也不会因为卡那霉素抗性基因扩散而改变其生存竞争特性,不会对自然生态平衡产生影响。

大量实验对卡那霉素抗性基因从转基因植物向土壤微生物扩散的可能性进行了分析。

许多研究都表明:基因转移是很难发生的,Smalla等[22]将含有npt2Ⅱ的转基因甜菜种在大田里,从土壤中筛选了5000个卡那霉素抗性菌,但PCR和杂交鉴定表明没有基因的水平扩散。

3.3　抗生素医疗安全性
转基因植物中卡那霉素抗性基因会不会扩散到病原微生物中,引起抗生素的医疗无效?在人类医学中,由于自然界中大量卡那霉素抗性微生物的存在,且卡那霉素在临床应用中毒副作用大,卡那霉素已被更安全有效的氨基糖苷类抗生素所取代;另外,卡那霉素抗性基因向潜在的病原微生物转移本身几乎不可能,因此,也不会导致更有害的微生物使现在的抗生素药物对其没有办法。

所以,转基因植物中的卡那霉素抗性基因对人类不存在抗生素医疗安全性问题。

在兽类医学中,卡那霉素相对用量较大,但自然界天然存在卡那霉素抗性细菌,所以由于转基因的扩散造成抗性细菌的产生并不会显著改变抗性细菌数量。

3.4　食用安全性
一般转基因植物中卡那霉素抗性基因的表达量很低,Vries等[23]通过标记拯救转化可检测出转基因植物基因组中npt2Ⅱ基因的含量。

如转基因番茄F LAVR2S AVRT M中卡那霉素抗性基因的最高表达量不超过总蛋白的0.1%,而APH(3′)2Ⅱ蛋白在番茄果实总蛋白中的比例小于0.08%,由此我们可以推算出人体的每天摄入量不超过25～74ngΠ(kg体重・d),而用大肠杆菌表达的APH(3′)2Ⅱ蛋白所做的小白鼠急性毒性试验中,饲喂剂量达
11
第6期王紫萱等:卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基因的生物安全性评价
5000mgΠkg体重时,无不利影响[1]。

还有,APH(3′)2Ⅱ蛋白与已知的毒性蛋白相比无明显的同源性,该蛋白降解成多肽后,亦无证据说明比其它蛋白降解后的多肽毒性大。

到目前为止,还没有相关文献报道卡那霉素抗性基因编码蛋白对人兽有直接毒性。

4　问题与展望
随着转基因技术的广泛应用,卡那霉素作为筛选剂在植物转基因中起着越来越大的作用,它不仅应用于转化过程中的筛选,而且渐渐被推到大田中,应用到转基因植株后代的筛选当中去,特别是能更方便地研究转基因植物后代的遗传特性。

今后如何选择最佳时期、最佳方法,确定最适浓度仍是提高卡那霉素筛选效率的关键问题。

同时也需要摸索出更多更好的方法,以适用于从转化过程到转化后代的各个不同时期的筛选。

随着转基因植物的增多,卡那霉素抗性基因的安全性问题越来越受到人们的普遍关心。

尽管现在的一些研究表明:卡那霉素抗性基因是安全的,但世界上首例释放上市的转基因植物距今也只有六七年的时间,其长期效应如何、风险性可能有多大等问题目前还无法得出最终的结论,对它的跟踪实验还需要相当长的时间。

所以,在转基因技术的研究和开发上既不能全盘否定,也不能盲目乐观。

所以,笔者认为:第一,由于转基因产品风险的出现具有长期的滞后性,一方面,对转基因植物的安全问题需要进行长期的系统研究,对转基因植物的推广一定要慎之又慎;另一方面,应加强生物安全的研究和能力建设,提高公众的生物安全意识和我国的生物管理水平,以便更有效地保护我国的生物多样性、生态环境和人体健康,促进我国生物技术的健康发展。

第二,虽然转基因植物给人类带来了巨大的经济效益和社会效益,但它潜在的危险性就目前的知识水平还无法预测,所以培养无抗生素抗性基因的转基因植物值得研究。

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21中　国　生　物　工　程　杂　志第23卷
The Application of K anamycin in Transgenic Plants
and the Biosafety Assessment of K an r
G ene
Wang Z ixuan Y i Z ili
(Hunan Agricultural University Cell Engineering K ey Laboratory Changsha 410128)
Abstract The functional mechanism and applications of K anamycin in screening transgenic plants and their progenys were reviewed.K anamycin could apply to distinguish the trans formants from non 2trans formants during trans formation ,and to genetic analyses of trans formed progenys ,or purity assay of seeds ,m oreover to screen the mature plants of trans formed progenys in the field .With the wide application of K anamycin ,its biosafety was m ore and m ore em phasized .In this paper ,the advances were summarized on the weeding of transgenic plants ,horizontal expansion of K anamycin gene ,and its safety for medicine and food.
K ey w ords K anamycin Transgenic plant Biosafety
(上接第8页)
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Progress of HIV 2T atPTD in Medicine
Ding Jin Ma Bin Liu Jun Xue Caifang
(Department of E tiology The F ourth M ilitary M edical University X i ’an 710032)
Abstract C om pounds ,peptides or DNA linked covalently with HI V 2T atPT D could enter cells in a receptor and transporter 2independent fashion.S ome of them can even cross the blood 2brain barrier.Up to date ,the exact mechanism in which the T atPT D is able to target and to transverse lipid membranes remains unknown.Characterized with prominent transduction activity ,T atPT D has been widely applied in medical research ,and w ould be a potent tool for the treatment of human disease.
K ey w ords Protein transduction domain (PT D )　HI V 2T at
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1第6期
王紫萱等:卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基因的生物安全性评价。