一氧化氮

NO的生物学特性
NO是一种tl由基性质的气体，其在组织中的半减期仅有10—60 s，其反应活性取决于它被去除或破坏的速度。

NO具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，到达临近靶细胞发挥作用。

由于体内存在氧及其他能与NO反应的化合物如超氧阴离子，血红蛋白等。

因而NO在体内极不稳定，合成后3～5 s即被氧化，以硝酸根(N )和亚硝酸根(N )的形式存在于细胞内、外液中。

N O 的生成和作用
在体内。

NO的合成需要NOS催化，以L一精氨酸为底物，以还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为电子供体，生成NO和L一瓜氨酸。

NO没有专门的储存及释放调节机制，靶细胞上NO的多少直接与NO的合成有关，而NO的合成则与NOS的活性密切相关。

哺乳动物体内的许多组织如血管内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞以及脑组织等均能合成NO。

N O 的生成主要有三种来源: 内皮细胞、神经细胞、神经胶质细胞。

内皮细胞源性N O体内、外研究都表明,内皮细胞源性N O 是一种强有力的血管扩张物质。

受乙酞胆碱作用时, 内皮细胞释放N O, 刺激平滑肌内的鸟昔酸环化酶使c G M P 增加从而导致脑血管的扩张。

除乙酞胆碱外, 5 一经色胺、P 物质和A D P 扩张脑微循环的作用也依赖N O 形成。

生理情况下产生的N O 除对脑血管有扩张作用外, 还可通过抑制血小板和白细胞的聚集而保护脑内皮细胞。

最近有报道, 生理情况下产生的N O 可以抑制脑微循环的自主性运动, 并对去甲肾上腺素、6 一经色胺等物质导致的脑动脉收缩有抑制作用。

神经元源性N O神经元源性N O 可能是神经元激活时脑血管反应的介质。

有人观察到小脑顶核和胆碱能纤维兴奋时所产生的脑血流增加可被N O S 抑制剂
所抑制。

许多研究提示,谷氨酸受体激活在神经元产生N O 过程中起关键作用。

有研究表明, 戊四氮吟和二氢哈尔碱h( ar m al in e) 诱发癫痛过程中可产生兴奋性氨基酸的内源性蓄积也引起脑中依赖于N O 的c G M P 大量增加。

培养细胞研究表明, 除谷氨酸外, 乙酞胆碱、血管紧张素、缓激肤、6 一经色胺、神经肤和内皮素等引起的血管反应与神经元源性N O 也有密切关系。

然而发现培养的皮层神经细胞和神经胚瘤细胞用脂多糖刺激, 不能象内皮细胞一样产生
N O S。

有研究表明, 神经纤维对脑大动脉和软脑膜动脉是由含N O S 的神经纤维支配调控这些神经纤维主要发自蝶鳄神经节, 其中的神经元可被N O S 和N A D P H一硫辛酞胺脱氢酶强染色。

许多功能性研究表明, 在体外用电或烟碱刺激血管壁中的神经纤维使其兴奋引起的管壁松”公也具有N O 依赖性。

胶质细胞源性N O 目前的研究认为, 能够产生N O 的胶质细胞主要是星形胶质细胞,至于其它胶质细胞能否产生N O 尚不清楚。

研究发现, 星形胶质细胞激活时可产生大量N O,并引起脑动脉的扩张。

1 NO对细胞凋亡的双重调控
一方面，NO可以促进细胞凋亡的发生。

在许多不同种类的鼠和人的细胞中都可以观察到NO引起的凋亡。

NO可以通过多种途径来诱导细胞凋亡，主要的机制包括：①诱导细胞DNA的损伤J。

NO可以抑制DNA分子的修复过程；增加具有遗传毒性的物质的产量，如烷化剂和过氧化氢等；活性NO类物质(RNOS)，如过氧亚硝酸盐和三氧化二氮，直接作用于DNA结构，损伤DNA和抑制DNA 修复机制。

②增加肿瘤抑制基因p53的表达。

p53蛋白在N0调控细胞周期调节因子或凋亡蛋白(如p21或Bax)的过程中是不可或缺的，它和诱导细胞凋亡有密切的关系，并且能够使细胞停滞在DNA损伤状态。

③诱导线粒体膜通透性的改变并促进细胞凋亡。

NO可通过线粒体膜电位降低直接介导细胞色素c的释放，而胞浆内的细胞色素c可以活化半胱天冬酶(caspase)依赖的细胞凋亡信号通路。

④炎症过程中过多NO的产生可上调环氧化酶2(COX-2)的表达，诱导多种细胞凋亡j。

研究还发现COX-2的代谢产物参与NO诱导的血管平滑肌细胞的凋亡。

⑤通过激活多种激酶来诱导凋亡。

如蛋门激酶C，p38等。

另一方面，NO可以抑制细胞凋亡的发生。

它具有广泛的抗凋亡功能，包括瞬时干预发射捌亡前体信号的caspase以及通过细胞保护蛋白质的表达促使NO的氧化还原活性分子S．硝酰化或亚硝基化而阻断caspase级联反应，如热休克蛋白(HSP)32和HSP70，从而延缓细胞的凋亡。

其抑制细胞凋亡的机制主要有：①通过环核苷酸和神经酰胺来发挥抗凋亡作用。

NO结合并激活鸟苷酸环化酶(GC)来产生cGMP，从而抑制多种细胞系的凋亡。

②通过caspase酶的半胱氨酸活性位点的s一亚硝基化来抑制caspase。

用二硫苏糖醇抑制caspase的硝基化作用能够逆转NO的凋亡抑制作用¨。

③抑制线粒体的呼吸。

生理浓度的NO能够通过膜去极化和钙离子的聚集而可逆地抑制线粒体膜通透性转运孔(PTP)的开放，显著的降低细胞色素C的释放，抑制细胞的凋亡
总体说，高浓度的NO会增强细胞凋亡，低浓度时则会延缓细胞凋亡
2 NO及其衍生物的神经毒性作用机制
NO一般是通过与可溶性鸟苷酸环化酶中的血红素组分起反应而发挥其生物学作用。

但在NO过量等条件下，NO又通过与其他化学分子发生不可逆的化学反应生成一些衍生物，此时NO与其衍生物常具有神经毒性作用。

超氧阴离子作为机体氧化还原的产物在体内广泛存在，当NO与0 同时存在且比例为1：1时可产生过氧化亚硝酸根(ONOO一)，虽然NO与0 都不是强氧化剂。

但ONOO 一具有强氧化性；它不仅tl身有毒，而且还可与H 形成HN03。

ONOO一相对稳定，但HNO3在37℃pH为7时。

半减期仅为1 s，很快被分解为多种毒性代谢产物，如N 、OH一、N 、N 等，其中N0 和ONOO一一般是损伤性的。

超氧阴离子常对机体有用，而羟自由基是有害的。

机体常通过内在的各种抗氧化机制来清除ONOO一等有毒物质。

但这种保护作用总是有限的，“当体内合成这些毒性产物的量超过了机体所能清除的限度，就会对机体的特定组织和器官如脑组织造成损伤。

ONOO一的细胞毒作用机制包括以下几个方面：
2，1 作为强氧化剂介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化
首先，氧化小分子(如半胱氨酸、谷胱甘肽)的巯基可破坏细胞内外灭活自由基的重要保护机制。

引起许多重要大分子物质如DNA、酶、结构蛋白、结构多糖、膜脂质等的损伤和破坏。

其次，氧化含巯基的蛋白质和巯基辅基(如辅酶A、硫辛酸、硫氧化还原蛋白等)可破坏正常的代谢通路和膜功能，引起细胞代谢和合成功能异常。

可导致细胞损伤甚至死亡。

2，2 ONOO一可通过对具有细胞调节功能的重要蛋白质的酪氨酸进行硝基化而发挥毒性作用。

2．3 具有强烈的抑制细胞线粒体氧化呼吸的作用NO与超氧
阴离子反应生成ONOO一后所产生的神经毒性作用是由N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)受体介导的，并被认为是多种急慢性神经元损伤。

如创伤、局灶性缺血、获得性免疫缺乏综合征(AIDS)痴呆及其他神经变性疾病损伤最后共同通路的原因。

当皮质神经元暴露于相对短时间或低浓度的NMDA、S一亚硝基半胱氨酸(均可产生低水平的ONOO一)时，所引起的是一种以细胞凋亡为特征的迟缓神经毒性作用；用SOD和过氧化氢酶预处理可部分消除s一亚硝基半胱氨酸引起的细胞凋亡作用。

相反。

暴露于高浓度的NMDA或ONOO一，或常时间暴露于其中，
诱发的是以急性细胞肿胀、溶解为特征的细胞坏死性损伤，而且不能被SOD和过氧化氢酶所消除。

可见，不同浓度的ONOO一可产生不同性质的细胞损害。

另外。

体内过量NO还可通过以下机制损伤DNA：①致DNA碱基脱氨基。

②致DNA氧化(由NO或其产物ONOO一及OH所致)。

③致亚硝氨含量增加，此为DNA烷化因子。

④抑制DNA
损伤的修复。

损伤的DNA可激活多聚ADP，核糖合成酶(PARS)，导致细胞氧化型辅酶I／还原型辅酶I(NAD／NADH)池的快速减少，ATP储存衰竭而发生细胞死亡。

此外，NO还可引起多种细胞发生凋亡。

2 NO的神经毒性作用
过量的NO具有神经毒性，在帕金森氏病(Parkin．son disease，PD)、早老性痴呆(Alzheimer disease，AD)、亨庭顿氏舞蹈症(Huntington disease，HD)和肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，AI5)等神经退行性疾病及脑缺血损伤等发生发展过程中，均伴随特定种类的神经细胞发生过度凋亡。

因此NO引起细胞损伤可能是中枢神经系统疾病的病因之一。

众多学者认为兴奋性氨基酸毒性作用、线粒体机能障碍引起能量代谢损耗以及氧化应激可能是神经退行性疾病的最后共同通路⋯。

而NO可能主要通过上述3种机制致神经细胞损伤。

2．1 NO与兴奋性氨基酸作用
在NO造成神经细胞损伤的多种途径中，NO与NMDA受体之间的关系相互作用一直倍受关注。

目前认为，脑内谷氨酸释放增加时，使NMDA受体依赖的钙通道过度激活，引起电压依赖性镁离子NMDA受体通道的阻断减弱，ca内流并与钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合，从而使受Ca“一CaM 调节的nNOS大量
激活，导致合成过量的NO，NO又可与细胞内过量的超氧阴离子0 结合生成过氧化亚硝酸根ONO0
‘，产生强烈的神经毒性，导致细胞死亡。

用原代培养的胎鼠大脑皮层神经元。

、小脑颗粒细胞J、中脑非多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能神经元都可观察到NO介导了NMDA的神经毒性。

在体实验中，给大脑皮层、海马和纹状体注入谷氨酸或外源性的NO都可引起神经元损伤并被NOS抑制剂全身给药所减轻，使坏死区减少，死亡细胞减少。

另外，已证实NO参与脑缺血时NMDA 的神经毒性。

但并非所有的实验结果均支持NO参与NMDA的神经毒性。

Pauwels 发现在原代培养的大鼠海马神经元中，当抑制了NO的产生，谷氨酸仍能产生神经毒性。

又有学者发现大脑小颗粒细胞NOS抑制剂不能拮抗谷氨酸的神毒性。

因此N一甲基．D一天冬氨酸受体介导的神经毒性是部分依赖于NO的。

除此之外，外源性神经毒物也可通过NMDA受体激活ca2 通道，使NO合成增多，如l一甲基-4一苯基一l，2，3，6四氢吡啶(1一methyl一4一phenyl
—l，2，3
6-tetrahydropyridine，M P) 、丙二酸、3．硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP) 和喹啉酸(quinolinic acid，QA) 等。

2．2 NO与线粒体损伤
近年来关于线粒体的研究有了突飞猛进的发展，已发现线粒体基因结构与功能的改变可能是导致老龄化和退行性疾病的重要因素。

而由NO引起的线粒体功能障碍可能是AD和PD等神经退行性疾病的病理机制之一⋯。

从1994～1997年，Bolanosl1 ’”。

和Mitrovic”进行系列研究，证明接触NO和内源性的NO均参与了对线粒体呼吸作用的抑制。

除此之外内源性NO还参与环境因子对线粒体呼吸功能的影响。

Schulz 用M P、丙二酸、3-NP 3种环境毒物制成神经退行性疾病的动物模型。

应用nNOS抑制剂可降低这3种毒物的神经毒性，并减少OH一和硝基酪氨酸的生成。

Cleeter 等又相继报道应用外源性NO 如：S一亚硝基谷胱甘肽(GSH)和硝普钠等可以可逆性地抑制线粒体电子传递链细胞色素氧化酶和三羧酸循环的关键酶顺乌头酸。

stamlerll 推测NO与Fe—s基因中的Fe发生配位结合，可抑制非血素酶的活性。

而线粒体中的泛醌氧化还原酶，琥珀酸氧化还原酶，顺乌头酸氧化还原酶等均为含有Fe—s中心的蛋白质，其活性依赖于所含的Fe。

最近有发现，线粒体也是细胞内NO产生的重要来源，线粒体内有独立于胞浆的NOS，所生成的NO可能对线粒体呼吸具有更直接的抑制作用h 。

到目前为止，关于NO引起线粒体DNA损伤的相关报很少。

已发现NO和ONO0一可引起血管内皮细胞、平滑肌细胞与成纤维细胞线粒体DNA—RNA转录水平的下降，ONO0一还可影响线粒体蛋白合成，ATP水平，并损伤线粒体的氧化还原功能
¨研究发现ONO0‘使PC12细胞出现明显的线粒体DNA的损伤，同时出现bcl一2高表达。

这一结论表明NO及氧化应激所导致的线粒体DNA损伤参与了神经退行性疾病的发生。

2．3 NO与氧化应激氧化应激学说在研究神经毒性机制中占有重要地位。

因此，近几年来倍受关注。

中枢神经系统对活性氧(reactive oxygen species，ROS)的攻击特别敏感，ROS可攻击蛋白质、脂质膜，破坏细胞的功能和完整性，并通过对DNA的直接或继发性损伤引起神经细胞凋亡。

NO是一种不稳定的气体自由基，因带有不配对的电子，所以NO易与体内许多生物分子如0，‘发生化学反应，形成许多产物。

这些生成物一方面可直接作用于组织器官，另一方面新生成的自由基又可以引发体内自由基的链式反应，加重对机体的损伤。

在NO参与氧化应激反应中，OH和ONO0一的损伤最为严重。

前面述及NMDA受体介导的神经毒性作用，也依赖于NO的反应生成物ONO0 。

有研究发现运动神经元持续低剂量地暴露于谷氨酸中，其产生的由NO 介导的神经毒性可通过cGMP信号传导途径，保护非运动神经元。

这种保护作用可能是由于细胞中，GSH减少0 的产生从而抑制NO转化成ONO0一。

所以可推断既然NO和0；的反应可以介导许多细胞毒性作用，所以NO／O 之间的平衡非常重要。

在研究外源性化合物引起的氧化应激时，NOS的特异性抑制剂可以剂量依赖性的拮抗兴奋性毒物喹啉酸引起的旋转行为和脂质过氧化。

在多巴胺自氧化和ROS引起多巴胺能神经元衰退时，应用NOS抑制剂L一单甲基精氨酸(L．NMMA)可抑制凋亡和氧化性产物N0生成“。

综上所述NO介导了内源和外源性化合物引起氧化应激所产生的神经毒作用。

而且大脑中不同细胞对NO 和其代谢产物ONO0一的易感性可能取决于细胞内超氧化物歧分酶(superoxide
dismutase，SOD)、GSH 的浓度和线粒体功能损伤后糖酵解的能力。

高水平的GSH可能使胶质细胞更能抵抗氧化性损伤。

所以神经元细胞与
维普资讯·胶质细胞相比，更易受NO和ONOO的攻击。

这能很好地解释许多神经疾患的发病机制，如多发性硬化及PD等。

2．4 NO与神经细胞凋亡前已述及，NO具有神经毒性。

应用外源性和内源性NO均可观察到多种类型的神经细胞凋亡的发生。

近年许多证据表明，神经细胞凋亡是AD、PD和ALs等神经退行性疾病发生的主要环节。

B．淀粉样蛋白，5-羟多巴，M P和氧化应激均可导致体外培养的神经细胞凋亡。

NO作为细胞凋亡的促发因子，在其中充当了重要的角色和作用。

并
且NO引起细胞凋亡与前面述及的兴奋性氨基酸毒性作用、线粒体机能障碍以及氧化应激关系密切。

已知的NO引起细胞凋亡的主要机制有以下几种：(1)NO可引起P53或bc1．2基因的表达；(2)NO使细胞内的铁明显丢失，使细胞生长和增殖受影响；(3)NO作用于DNA，使DNA脱氨基，或引起DNA断裂而形成碎片；(4)NO阻断呼吸链电子传递，使ATP合成不足；(5)NO与O；形成ONOO。

产生细胞毒作用；(6)NO作用于DNA结合蛋白，影响DNA的转录；(7)NO与巯基化合物形成亚硝基硫醇。

NO对脑的作用
脑组织中的NO作为一种脂溶性的小分子化合物，合成后可迅速透过生物膜进入周围细胞，通过对多种酶和受体进行化学修饰而发挥生理和病理作用，这些酶和受体一类为蛋白质的血红素辅基和铁硫中心，如可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate，sGC)，NO通过激活sGC，增加cyclic GMP(cGMP)的产生，cGMP又可通过调节多种离子通道发挥信号传导功能。

另一类为某些活性巯基，如N．甲基．D．天冬氨酸(N—methyl—D．aspartate，NMDA)受体的氧化还原调控位点。

而且NO还可对许多神经递质的释放进行调控，如多巴胺、乙酰胆缄和谷氨酸等。

目前发现NO参与脑内生理功能主要包括：参与海马长时程增强(1ongterm potentiation，LTP)、小脑的长时程抑制(1ong．term de—pression，LTD)、大脑血液的调控、记忆的形成以及神经递质(谷氨酸)的释放调节等。

NO诱导的细胞凋亡与神经系统疾病的发生在神经系统，肿瘤、癫痫、脑缺血、外伤以及阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等神经退行性变时均有细胞凋亡的参与，NO分子在其中发挥着重要作用。

正常生理条件下产生的NO在中枢神经系统中发挥有利作用，但是内源性或外源性NO的产生和过量释放则会直接导致神经毒
性。

NO介导了缺氧／缺糖损伤时脑皮质细胞的死亡，而降低NO的过量释放则可拮抗神经元的缺氧／缺糖损伤。

NO对处于缺氧条件下的大脑是产生毒性还是保护作用，主要取决于细胞内区间分布及NO产生的水平和部位。

nNOS和iNOS 合成的NO具有神经毒性，而eNOS合成的NO则通过维持大脑【f【L液的流动而保护脑组织不受毒害。

在中枢神经系统中，炎症条件下，星状细胞(As)和胶质细胞均可表达iNOS，产生大量NO，导致神经元坏死或凋亡。

尤小胶质细胞(Mi)在涉及神经元死亡的神经系统疾病的发病机制中发挥着重要的作用，参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。

NOS抑制剂或抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。

所以NOS的激活和NO的产生在神经退行性疾病、啮缺血、多发性硬化症、脊髓损伤及溶酶体疾病(Krabbe
’S疾病)等发病过程中作为治疗靶点已被逐渐接受。

另一方面，NO供体药物s 一亚硝基谷胱甘肽(GSNO)作为抗氧化剂、抗炎和神经保护剂，通过NF—KB通路介导神经保护，并促进哺乳动物中枢神经细胞神经营养因子的分泌，用于脑缺咀的治疗。

研究者们认为对NO的调节必须达到精确的平衡状态，在调节宿主防御、神经传递和血管舒张等方面要接近生理水平，而在调控神经组织损伤和脱髓鞘作用方面要阻断NO的过度增多，从而达到治疗疾病的目的。

脑缺血时N O 的作用可能既有益又有害。

bg其有益作用是可以维持脑血流, 抑制血小板白细胞的聚集和粘附。

同时, N O 还可以阻断N M D A 受体, 从而对由于N M D A 受体激活导致的细胞损伤具有保护作用。

当N O 产生过度时则可以产生有害作用, 因为N O 可以直接或与超氧化物结合后而产生细胞损害。

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