反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药的含量_贺建荣
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动相溶解并定量稀释制成约25 μg/ml溶液，按照上述色 谱条件测定峰面积，每个样品重复进样 3 次。按标准曲 线计算含量(表3) 。
表3 根皮苷含量测定结果
Tab.3 Results of phloridzin determination
批号
理论浓度 （μg/ml）
实测浓度 （μg/ml）
含量(%)
色谱柱：Iinertsil ODS-3 (150 mm×4.6 mm，5 µm)；
·712·
南方医科大学学报（J South Med Univ）
第 31 卷
流动相为乙腈-0.15%磷酸 (25∶75)；流速1 ml/min；检测 波长 285 nm，进样量 20 μl，温度 30 ℃。在此色谱条件 下，取适当浓度的照品溶液、供试品溶液分别进样测定， 色谱图见图 1，理论塔板数按根皮苷峰计不低于 3×103， 根皮苷的保留时间为6.9 min，其他组分对测定无干扰。
［2］ Masumoto S, Akimoto Y, Oike H, et al. Dietary phloridzin reduces blood glucose levels and reverses Sglt1 expression in the small intestine in streptozotocin-induced diabetic mice［J］. J Agric Food Chem, 2009, 57: 4651-6.
1 材料 1.1 仪器
美国 Agilent 1100 高效液相色谱仪，DAD 检测器；
收稿日期：2010-12-11 基金项目“：重大新药创制”科技重大专项项目(2011ZX09401-308-19) 作 者 简 介 ：贺 建 荣 ，副 主 任 药 师 ，电 话 ：029-84777846，E-mal: lvshanqiang@163.com 通讯作者：王庆伟，主管药师，博士学位，电话：029-84777716，E-mail: wqwlxy@fmmu.edu.cn
第4期
贺建荣, 等.反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药的含量
·713·
液为流动相，色谱峰峰形对称，分离效果最佳。 本实验所述的色谱条件，亦适用于根皮苷制剂的有
关物质检查。
参考文献：
［1］ Mate A, Hermosa MA, Barfull A, et al. Decreased monosaccharide transport in renal brush-border membrane vesicles of spontaneously hypertensive rat［s J］. Cell Mol Life Sci, 2000, 57(1): 165-74.
52.83
52.56
99.69
97.06
97.16
100.10
中
100.30
99.83
99.53
99.46
0.6884
98.38
97.14
98.74
200.60 199.40
99.40
高
202.30 202.50 100.10
99.56
0.4756
198.80 197.20
99.20
2.7 含量测定结果 避光操作。分别取 3 批样品适量，精密称定，加流
C B
A
0
2
4
6
8
10
图1 HPLC色谱图
A：空白B：对照品C：供试品 Fig.1 HPLC of blank solution (A), control solution (B) and sample solution (C).
2.3 线性关系 精密量取根皮苷对照品储备液适量，置于 10 ml
的容量瓶中，用甲醇逐步稀释至刻度，摇匀得浓度分别 为 0.495、2.475、4.950、14.850、24.750、37.120、49.500 μg/ml的对照品溶液，分别吸取上述溶液20 μl色谱条件 下进样，记录峰面积，以峰面积 Y 对浓度进行回归，根皮 苷在 0.495~49.500 μg/ml 浓度范围内呈良好的线性关 系，回归方程为：Y=46.370 X-0.673 (r=0.9999，n=3)。 2.4 稳定性考察
表1 精密度实验结果
Tab.1 Precision of the method (n=3)
对照品浓度 (μg/ml)
精密度(%) 日内
0.495
1.080
14.850
0.773
49.500
0.189
日间 1.231 0.984 0.838
2.6 回收率试验
取根皮苷对照品低 (约 50 mg)、中 (约 100 mg)、高 (约 200 mg)3 个水平各 3 份，加流动相溶解并定容至 50 ml，量取 1 ml 用流动相稀释至适当浓度。色谱条件下 测定，计算根皮苷回收率（表 2）。
20091214
26.84
26.52
98.81
20101016
28.75
28.44
98.82
20101107
24.38
24.07
98.73
RSD(%)
0.6464 0.8689 0.3913
3 讨论 3.1 检测波长的选择
以甲醇为溶解和空白对照，190 nm~400 nm 范围 扫描，根皮苷在 200、234 及 285 nm 有最大吸收峰，在 285 nm 波长下仪器噪音响应小、基线平稳（色谱图 1 A），故选择285 nm 作为检测波长 3.2 色谱柱的选择
表2 根皮苷的加样回收率
Tab.2 Recovery rate of phloridzin from the loaded samples
序号
加入量 (mg)
回收量 (mg)
回收率 平均回收
(%)
wenku.baidu.com
率(%)
RSD (%)
48.35
48.26
101.50
低
50.11
49.21
98.43
99.17
0.8585
2 试验方法及结果 2.1 溶液的制备
精密称取根皮苷对照品 5.0 mg，置 10 ml 容量瓶 中，加流动相溶解并稀释至刻度，制备成500 μg/ml的对 照品溶液，低温避光保存备用。精密称量约50 mg根皮 苷原料药于 100 ml 量瓶中，加流动相定容成 50 μg/ml 的供试品溶液，低温避光保存备用。 2.2 色谱条件及系统适用性试验
2011;31(4)
南方医科大学学报（J South Med Univ）
·技术方法·
反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药的含量
·711·
贺建荣 1，刘雪英 2，王庆伟 1，叶子晨 3，畅 敏 1 1 第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038；2 第四军医大学药学系药物化学教研室，陕西 西安
Chemistry, 3Student Regimen, School of Pharmacy, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
Abstract: Objective To establish a reversed-phase high-performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method for determination of phloridzin content. Methods A RP-HPLC method was established for determination of phloridzin using an Inertsil ODS-3 (4.6×150 mm, 5 μm) column with the detection wavelength of 288 nm, flow rate of 1.0 ml/min, and column temperature of 25 ℃. Results The result showed that the phloridzin had a good linear relationship when its concentration ranged between 0.5988 and 89.72 μg/ml. The regression equation was Y=46.370 X-0.6728 (r=0.9999, n= 3). The average recovery of phloridzin was 99.40% with the relative standard deviations (RSD) of 0.67%. Conclusion This method is simple, quick and accurate for determination of phloridzin content. Key words: reversed-phase high-performance liquid chromatograph; phloridzin; determination
精密称取根皮苷原料 27.0 mg，加流动相溶解并定 量稀释成每13.5 μg/ml的溶液，在0、1、2、4、6、8、12 h 分 别进样20 μl，计算峰面积的 RSD为1.05%，说明根皮苷 至少在12 h内较稳定。 2.5 精密度考察
取低、中、高 3 个浓度的根皮苷对照品溶液，同一天 连续进样3次，进样量20 μl，测定峰面积，计算芝麻素的 日内RSD。连续3 d进样3次，测定峰面积，计算根皮苷 的日间 RSD。结果表明在该色谱条件下仪器精密度良 好(表 1)。
Determination of the content of phloridzin using reversed-phase high-performance liquid chromatography
HE Jian-rong1, LIU Xue-ying 2, WANG Qing-wei 1, YE Zi-chen3, CHANG Min1 1Department of Pharmacy, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China; 2Department of Medicinal
根皮苷是二氢查尔酮类化合物根皮素的葡萄糖 苷。根皮苷主要存在于苹果树的皮、茎、嫩叶以及苹果 果实中。根皮苷具有多种生物活性，如调节血压［1］、降 糖[2]、增强记忆力[3]、预防骨质疏松[4]、清除体内自由基[5] 等。根皮苷在新型药物和功能性食品的开发中占据独 特的地位，目前其研究引起了广泛关注。为了有效控制 根皮苷的质量，我们建立了可快速定量分析根皮苷原料 的反相高效液相色谱法。
德国Sartorius BP211D电子分析天平。 1.2 试剂
根皮苷对照品(第四军医大学药学系药物化学教研 室制备，经质谱、红外检定，HPLC 测定含量为 99.0%)； 根皮苷原料（第四军医大学唐都医院药剂科提取纯化， 批号：20091214、20101016、20101107）；甲醇、乙腈为色 谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。
710033；3第四军医大学药学系学员队，陕西 西安 710033
摘要：目的 采用反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药含量，以满足质量控制的要求。方法 采用 RP-HP LC 法，色谱柱 为 Inertsil ODS-3 柱(4.6×150 mm, 5 μm)。流动相为乙腈-0.15%磷酸(25∶75)，柱温 30 ℃，流速 1.0 ml/min，检测波长 285 nm。结果 此条件下根皮苷分离良好，在 0.4950~49.50 μg·mL-1 浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=46.370 X-0.673 (r=0.9999, n=3)，平均回收率为 99.40%，相对标准偏差为 0.67%。结论 建立根皮素原料药含量测定的 HPLC 方法 专属性强、灵敏度高，为根皮素质量控制提供参考依据。 关键词：反相高效液相色谱法；根皮苷；含量测定 中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）04-0711-03
先后选用了汉邦 Lichrospher C18 柱、依利特 Hypersil C18柱等，结果发现样品峰的峰形均不理想，有拖 尾、钝峰现象；换用 Iinertsil ODS-3 柱，发现峰形尖锐、 较对称。 3.3 流动相的选择
考虑到根皮苷为多羟基酚类化合物，极性较大，实 验先后考察了甲醇- 水、乙腈-水及甲醇-0.15%磷酸水溶 液等溶剂系统，结果表明，以乙腈 -0.15%磷酸磷酸水溶
表3 根皮苷含量测定结果
Tab.3 Results of phloridzin determination
批号
理论浓度 （μg/ml）
实测浓度 （μg/ml）
含量(%)
色谱柱：Iinertsil ODS-3 (150 mm×4.6 mm，5 µm)；
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南方医科大学学报（J South Med Univ）
第 31 卷
流动相为乙腈-0.15%磷酸 (25∶75)；流速1 ml/min；检测 波长 285 nm，进样量 20 μl，温度 30 ℃。在此色谱条件 下，取适当浓度的照品溶液、供试品溶液分别进样测定， 色谱图见图 1，理论塔板数按根皮苷峰计不低于 3×103， 根皮苷的保留时间为6.9 min，其他组分对测定无干扰。
［2］ Masumoto S, Akimoto Y, Oike H, et al. Dietary phloridzin reduces blood glucose levels and reverses Sglt1 expression in the small intestine in streptozotocin-induced diabetic mice［J］. J Agric Food Chem, 2009, 57: 4651-6.
1 材料 1.1 仪器
美国 Agilent 1100 高效液相色谱仪，DAD 检测器；
收稿日期：2010-12-11 基金项目“：重大新药创制”科技重大专项项目(2011ZX09401-308-19) 作 者 简 介 ：贺 建 荣 ，副 主 任 药 师 ，电 话 ：029-84777846，E-mal: lvshanqiang@163.com 通讯作者：王庆伟，主管药师，博士学位，电话：029-84777716，E-mail: wqwlxy@fmmu.edu.cn
第4期
贺建荣, 等.反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药的含量
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液为流动相，色谱峰峰形对称，分离效果最佳。 本实验所述的色谱条件，亦适用于根皮苷制剂的有
关物质检查。
参考文献：
［1］ Mate A, Hermosa MA, Barfull A, et al. Decreased monosaccharide transport in renal brush-border membrane vesicles of spontaneously hypertensive rat［s J］. Cell Mol Life Sci, 2000, 57(1): 165-74.
52.83
52.56
99.69
97.06
97.16
100.10
中
100.30
99.83
99.53
99.46
0.6884
98.38
97.14
98.74
200.60 199.40
99.40
高
202.30 202.50 100.10
99.56
0.4756
198.80 197.20
99.20
2.7 含量测定结果 避光操作。分别取 3 批样品适量，精密称定，加流
C B
A
0
2
4
6
8
10
图1 HPLC色谱图
A：空白B：对照品C：供试品 Fig.1 HPLC of blank solution (A), control solution (B) and sample solution (C).
2.3 线性关系 精密量取根皮苷对照品储备液适量，置于 10 ml
的容量瓶中，用甲醇逐步稀释至刻度，摇匀得浓度分别 为 0.495、2.475、4.950、14.850、24.750、37.120、49.500 μg/ml的对照品溶液，分别吸取上述溶液20 μl色谱条件 下进样，记录峰面积，以峰面积 Y 对浓度进行回归，根皮 苷在 0.495~49.500 μg/ml 浓度范围内呈良好的线性关 系，回归方程为：Y=46.370 X-0.673 (r=0.9999，n=3)。 2.4 稳定性考察
表1 精密度实验结果
Tab.1 Precision of the method (n=3)
对照品浓度 (μg/ml)
精密度(%) 日内
0.495
1.080
14.850
0.773
49.500
0.189
日间 1.231 0.984 0.838
2.6 回收率试验
取根皮苷对照品低 (约 50 mg)、中 (约 100 mg)、高 (约 200 mg)3 个水平各 3 份，加流动相溶解并定容至 50 ml，量取 1 ml 用流动相稀释至适当浓度。色谱条件下 测定，计算根皮苷回收率（表 2）。
20091214
26.84
26.52
98.81
20101016
28.75
28.44
98.82
20101107
24.38
24.07
98.73
RSD(%)
0.6464 0.8689 0.3913
3 讨论 3.1 检测波长的选择
以甲醇为溶解和空白对照，190 nm~400 nm 范围 扫描，根皮苷在 200、234 及 285 nm 有最大吸收峰，在 285 nm 波长下仪器噪音响应小、基线平稳（色谱图 1 A），故选择285 nm 作为检测波长 3.2 色谱柱的选择
表2 根皮苷的加样回收率
Tab.2 Recovery rate of phloridzin from the loaded samples
序号
加入量 (mg)
回收量 (mg)
回收率 平均回收
(%)
wenku.baidu.com
率(%)
RSD (%)
48.35
48.26
101.50
低
50.11
49.21
98.43
99.17
0.8585
2 试验方法及结果 2.1 溶液的制备
精密称取根皮苷对照品 5.0 mg，置 10 ml 容量瓶 中，加流动相溶解并稀释至刻度，制备成500 μg/ml的对 照品溶液，低温避光保存备用。精密称量约50 mg根皮 苷原料药于 100 ml 量瓶中，加流动相定容成 50 μg/ml 的供试品溶液，低温避光保存备用。 2.2 色谱条件及系统适用性试验
2011;31(4)
南方医科大学学报（J South Med Univ）
·技术方法·
反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药的含量
·711·
贺建荣 1，刘雪英 2，王庆伟 1，叶子晨 3，畅 敏 1 1 第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038；2 第四军医大学药学系药物化学教研室，陕西 西安
Chemistry, 3Student Regimen, School of Pharmacy, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
Abstract: Objective To establish a reversed-phase high-performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method for determination of phloridzin content. Methods A RP-HPLC method was established for determination of phloridzin using an Inertsil ODS-3 (4.6×150 mm, 5 μm) column with the detection wavelength of 288 nm, flow rate of 1.0 ml/min, and column temperature of 25 ℃. Results The result showed that the phloridzin had a good linear relationship when its concentration ranged between 0.5988 and 89.72 μg/ml. The regression equation was Y=46.370 X-0.6728 (r=0.9999, n= 3). The average recovery of phloridzin was 99.40% with the relative standard deviations (RSD) of 0.67%. Conclusion This method is simple, quick and accurate for determination of phloridzin content. Key words: reversed-phase high-performance liquid chromatograph; phloridzin; determination
精密称取根皮苷原料 27.0 mg，加流动相溶解并定 量稀释成每13.5 μg/ml的溶液，在0、1、2、4、6、8、12 h 分 别进样20 μl，计算峰面积的 RSD为1.05%，说明根皮苷 至少在12 h内较稳定。 2.5 精密度考察
取低、中、高 3 个浓度的根皮苷对照品溶液，同一天 连续进样3次，进样量20 μl，测定峰面积，计算芝麻素的 日内RSD。连续3 d进样3次，测定峰面积，计算根皮苷 的日间 RSD。结果表明在该色谱条件下仪器精密度良 好(表 1)。
Determination of the content of phloridzin using reversed-phase high-performance liquid chromatography
HE Jian-rong1, LIU Xue-ying 2, WANG Qing-wei 1, YE Zi-chen3, CHANG Min1 1Department of Pharmacy, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China; 2Department of Medicinal
根皮苷是二氢查尔酮类化合物根皮素的葡萄糖 苷。根皮苷主要存在于苹果树的皮、茎、嫩叶以及苹果 果实中。根皮苷具有多种生物活性，如调节血压［1］、降 糖[2]、增强记忆力[3]、预防骨质疏松[4]、清除体内自由基[5] 等。根皮苷在新型药物和功能性食品的开发中占据独 特的地位，目前其研究引起了广泛关注。为了有效控制 根皮苷的质量，我们建立了可快速定量分析根皮苷原料 的反相高效液相色谱法。
德国Sartorius BP211D电子分析天平。 1.2 试剂
根皮苷对照品(第四军医大学药学系药物化学教研 室制备，经质谱、红外检定，HPLC 测定含量为 99.0%)； 根皮苷原料（第四军医大学唐都医院药剂科提取纯化， 批号：20091214、20101016、20101107）；甲醇、乙腈为色 谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。
710033；3第四军医大学药学系学员队，陕西 西安 710033
摘要：目的 采用反相高效液相色谱法测定根皮苷原料药含量，以满足质量控制的要求。方法 采用 RP-HP LC 法，色谱柱 为 Inertsil ODS-3 柱(4.6×150 mm, 5 μm)。流动相为乙腈-0.15%磷酸(25∶75)，柱温 30 ℃，流速 1.0 ml/min，检测波长 285 nm。结果 此条件下根皮苷分离良好，在 0.4950~49.50 μg·mL-1 浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=46.370 X-0.673 (r=0.9999, n=3)，平均回收率为 99.40%，相对标准偏差为 0.67%。结论 建立根皮素原料药含量测定的 HPLC 方法 专属性强、灵敏度高，为根皮素质量控制提供参考依据。 关键词：反相高效液相色谱法；根皮苷；含量测定 中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）04-0711-03
先后选用了汉邦 Lichrospher C18 柱、依利特 Hypersil C18柱等，结果发现样品峰的峰形均不理想，有拖 尾、钝峰现象；换用 Iinertsil ODS-3 柱，发现峰形尖锐、 较对称。 3.3 流动相的选择
考虑到根皮苷为多羟基酚类化合物，极性较大，实 验先后考察了甲醇- 水、乙腈-水及甲醇-0.15%磷酸水溶 液等溶剂系统，结果表明，以乙腈 -0.15%磷酸磷酸水溶