同步荧光分析法测定生物蛋白质

实验题目：测定生物样品中的蛋白质（同步荧光法）

1.实验原理：蛋白质是一类重要的生物大分子，它是构成生命体最重要的物质基础之一。蛋白质的定量测定是临床检验中诊断疾病及检查治疗效果的重要指标。因此，蛋白质定量测定在化学、生物、医药、食品等各相关学科中已经成为一个非常热门的研究课题。

血清白蛋白是动物和人体血浆中重要的载体蛋白，它能和许多种内源或外源化合物产生作用，承载着将药物运输到达靶点产生药效和储存药物延长药效等重要作用，对研究药物的药效和药理及临床用药有重要意义。蛋白质测定较常用的经典方法有凯氏定氮法、Lowry法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法b1等，其中，凯氏定氮法因其适用样品广泛，测试结果准确，是常用分析有机化合物含氮量的经典方法之一。近来又发展了一些新方法如荧光光度法、化学发光法和共振光散射法[等。同步荧光光谱法自1971年被提出以来，由于其与常规荧光分析法相比具有灵敏度高、选择性好、光谱简化、谱带窄化及可减小散射光影响等优点，已成功地应用于多组分的同时测定以及生物分子的研究中。

2.仪器与试剂：FP-6500荧光分光光度计(日本分光公司)；T-6紫外一可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)；PB．10型酸度计(北京赛多利斯仪器系统公司)；BS．110S型电子天平(北京赛多利斯天平公司)；脱氧尿苷1．0×10。3 mol／L水溶液；人血清白蛋白(HSA，华兰生物工程公司)4．0×10。5 mol／L水溶液，在冰箱中保存(1～4 oC)；pH 7．4的％s．HCI 缓冲溶液；考马斯亮蓝溶液(溶液中含0．0l％考马斯亮蓝G-250，4．7％乙醇，8．5％磷酸)；0．5 mol／L的NaCl水溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。

3. 实验方法：于10 mL比色管中依次加入：pH 7．4的Tris．HCl缓冲溶液2．0 mL，0．5 mol／L的NaCI溶液2．0 IllL，一定体积的HSA标准溶液，1．0×10。mol／L的脱氧尿苷溶液O．2 mL，用水定容至刻度，摇匀，用1 cm石英吸收池，在△入=50 Rnm时扫描体系的同步荧光光谱。

4.注意事项：1）加入顺序的影响：考察了各种不同的物质加入顺序对体系同步荧光强度的影响。当加入顺序为Tris--HCI--NaCl--Deoxyuridine时体系的同步荧光强度最高、且稳定性最好。

2）反应时间和稳定性：在上述实验条件下，考察了反应时间对体系同步荧光强度的影响。结果表明，在室温下，该反应在5 min内即可完成，且体系的同步荧光强度至少在5 h内基本不变。

3)线性范围、回归方程、检出限：在最佳实验条件下，以体系的同步荧光强度对HSA浓度绘制标准工作曲线，线性回归方程为IsF=13．60246+211．19154×107 C(HSA)(mol／L)，相关系数为R=0．9991。测定的浓度范围在2．76～524.4微克每毫升之间。根据IUPAC的定义，对11份空白溶液进行平行测定，计算了方法的检出限为0.11毫克每毫升。