端粒酶与肿瘤的研究进展

端粒酶与肿瘤的研究进展
摘要: 端粒是真核细胞染色体末端的特定DNA序列及相关蛋白质组成的复合物，依赖一种特殊的逆转录酶——端粒酶合成。

近来的研究表明，肿瘤细胞中端粒有所改变，端粒酶活性也有异常。

这就提示我们针对端粒酶而开辟出一条攻克肿瘤的新途径。

近年来，关于肿瘤分子水平上的研究表明，肿瘤的发生与不同时期不同的原癌基因的激活与抑癌基因的失活有关。

这些基因的突变或缺失使细胞端粒酶活性表达，破坏正常细胞有丝分裂到一定程度便衰老，死亡的细胞周期，使其成为永生细胞。

正常体细胞端粒酶处于失活状态。

本文将对端粒酶与肿瘤关系方面的一些研究作以简要综述。

关键词: 端粒；端粒酶；肿瘤；肝癌；衰老；治疗
引言：最早观察染色体末端的科学家始于19世纪末期，Rabl[1]在1885年注意到染
色体上所有的末端都处于细胞核的一侧。

20世纪30年代，两个著名的遗传学家
McClintock B [2]和Muller HJ [3]发现了染色体的末端可维持染色体的稳定性和完
整性。

Muller将它定义为“telomere”，这是由希腊词根“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的。

30多年前，Hayflick[4]首次提出将体外培养的正常人成纤维细
胞的“有限复制力”作为细胞衰老的表征。

在此过程中，细胞群中的大部分细胞经历
了一定次数的分裂后便停止了，但它们并没有死亡，仍保持着代谢活性，只是在基
因表达方式上有一定的改变。

于是Hayflick猜测细胞内有一个限制细胞分裂次数的“钟”，后来通过细胞核移植实验发现，这种“钟”在细胞核的染色体末端——端粒。

但端粒究竟是怎样的复杂结构呢？Blackburn和Gall[5] 于1978年首次阐明了四膜
虫rDNA分子的末端结构，他们发现这种rDNA每条链的末端均含有大量的重复片段，
并且这些大量重复的片段多是由富含G、C 的脱氧核苷酸形成的简单序列串联而成。

在1985年，CW•Greider和EH•Blackburn发现将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜
虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这就说明了确实有这样的一种酶存在[6]，并
将它命名为“端粒酶”（telomerase）。

之后，耶鲁大学Morin于 1989年在人宫颈癌
细胞中也发现了人端粒酶[7] 。

近年来，随着人体端粒酶的发现和端粒学说的提出，
已经知道决定细胞衰老的“生物钟”就是染色体末端的端粒DNA，它可随着年龄的增长
而缩短。

端粒及端粒酶的概念：端粒（telomere)是真核细胞线性染色体末端由端粒DNA
和端粒蛋白质构成一种特殊结构，是富含GC的高度保守的重复核苷酸序列，包括Ku70、
Ku80、依赖DNA的蛋白激酶和端粒重复序列结合因子2（TRF2）等。

人的端粒DNA序列
由5'向3'方向的（TTAGGG)n重复串联组成，大约有2至15kb。

在正常情况下，随着细
胞分裂，端粒的进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞发生凋亡；细胞
培养研究表明，当端粒再也无法保护染色体免受伤害时，细胞就会停止分裂，或者
变得不稳定。

其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体免遭融合、重组和降解。

染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的
寿命，故而被称为“生命的时钟”。

端粒酶（或端粒体酶）是一种能延长端粒末端的
核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，其含有引物特异识别位点，以自身RNA为模
版，合成端粒DNA并整合到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使细
胞永生化。

近年来人们在超过80%以上的永生化细胞系及大多数肿瘤组织中检测到活化状态的端粒酶，而绝大多数正常体细胞组织端粒酶为阴性，因此普遍认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生和发展密切相关。

端粒酶的活化涉及了一系列基因表达和调控的变化，从而导致细胞增殖分化的异常。

端粒酶基因也可被认为是癌基因的一个重要成员。

根据目前的研究，端粒酶至少有三个亚单位组成，RNA亚单位
TR(telomeraseRNA)、端粒酶催化亚单位TERT(telomerase reverase transcriptase)和TEP1(telomerase-associated protien 1).
端粒及端粒酶的功能和作用机制：端粒：1、保护染色体末端免于降解，2、防止染色体断裂及互相融合，维持染色体稳定性，在端粒酶作用下进行复制。

端粒结构对于真核染色体DNA在复制过程中保持DNA的长度具有非常重要的作用。

真核生物染色体线性DNA复制时，随从联合成过程中的各片段去除引物后，是由DNA 聚合酶δ来填补空隙。

由于DNA聚合酶不能催化3'至5'方向合成反应，在DNA的末端，靠常规复制机制无法填补新合成的DNA链5'端引物去除后留下的间隙，这样会造成染色体DNA逐渐缩短。

端粒酶催化端粒DNA的合成能够延伸线性DNA的末端，保证DNA分子不会在复制过程中缩短。

端粒酶：端粒酶的基本功能在于合成端粒重复序列，维持端粒的长度。

在高等生物的正常细胞中，除了精原细胞和少数造血细胞外，其余体细胞端粒酶均处于失活状态，其端粒长度随着有丝分裂次数增加而逐渐缩短。

端粒重复序列的逐渐丢失将导致细胞的衰老死亡。

正常人体细胞每年大约要丢失15～40bp的TTAGGG重复序列。

端粒酶主要依靠两种成分来实现其功能，一种名为端粒酶逆转录酶(TERT)的蛋白酶，另一种是作为模板的一小段RNA序列。

“端粒酶只要这两样东西就可以起作用，但是实际上如果仅仅将它们简单地放到一起去，它们是不会组装成功能结构的，还需要一些其他的辅助作用。

我们在研究中发现端粒酶在这些卡哈尔体中以某种方式完成了组装。

”
在新研究中，研究人员发现在正常癌细胞生长条件下，细胞仅通过单个端粒酶分子作用合成修复端粒，每经历一次细胞分裂单个端粒酶分子就在端粒末端添加60个核苷酸。

而当研究人通过抑制端粒酶的方式人为缩短端粒时，他们发现有多个端粒酶分子在端粒末端发挥作用。

此外，研究人员还发现细胞内一种称为卡哈尔体(Cajal bodies)的细胞器对端粒酶的组装起重要的作用。

端粒酶活性的检测：最早测定端粒酶活性至少需108个细胞，1994年Kim等建立
了TRAP法，可以在104个细胞中测出1个永生化细胞的端粒酶活性。

TRAP法首先从肿瘤细胞或组织中制备端粒酶提取液，然后进行TRAP反应，即在含有一条引物、dNTP 和TRAP缓冲液的反应体系中，加入端粒酶提取液，使端粒以其RNA组分为模板催化合成端粒DNA重复序列并以此为模版，加入另一条引物进行PCR扩增，扩增体系中加入标记的dATP（同位素、荧光素等标记物），扩增产物可通过凝胶电泳、放射自显影（同位素为标记物）后分析，以荧光素为标记物质通过扫描仪分析荧光曲线。

经典的端粒酶检测TRAP法分析结果是非线性的，使样品间的比较和定量比较困难，操作比较复杂且耗时多，也不适于小样品检测，而且由于有些组织中含有Tap酶抑制物，会出现假阴性结果。

为了解决凝胶电游操作繁琐的问题，有人利用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行TRAP操作，是大规模筛选临床样本成为可能。

其基本原理是将下游引物5’端用
生物素【Me-H3】TTP标记，扩增31个循环，吸取40微升的反应产物与50微升的链酶抗生物素蛋白包被的液态微球混合，3H-生物素标记的反应产物与微球相结合，当其接近反应发生器时，能激发含有3H的核酸液闪，从而产生信号并计数，这种结合接近液闪的TRAP技术，也可用于筛选端粒酶抑制剂。

ELISA法的原理是利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核酸端粒重复序列，反应产物用生物素标记的引物进行PCR扩增后，与地高辛标记的探针杂交，再与链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合，产生的有色底物用酶标仪测量结果。

该法优点为省时、无放射性污染，并可减少假阴性。

端粒酶活性调节:正常体细胞，肿瘤细胞核人组织胚胎细胞端粒酶活性各不相同。

人们提出这样一个假设；在胚胎发育过程中，端粒酶通常由生殖细胞合成，一旦功能发育成熟后，体细胞端粒酶活性均被抑制不显活性，其端粒随着每次的细胞分裂会缩短，当端粒短到一定阈值后会有某种信号发出使细胞不分裂。

然而若有某中促癌细胞的突变基因的突变阻止这种信号发出或使细胞对此信号无反应。

细胞会烧过正常的衰老过程继续分裂，染色体末端的端粒将继续缩短并使染色体异常，最后可能引起癌基因突变。

在通常情况下，当端粒完全或几乎完全丢失后，细胞终止分裂和增值。

但如果染色体异常所引起的基因重排能使被抑制的端粒酶重新被激活，激活的端粒酶将使已缩短的端粒DNA的得以复制，从而使细胞获得或得以保持无限分裂的能力变成肿瘤细胞，但有关端粒酶活性调节的细节所知甚少。

有实验证明；调节细胞凋亡的存活因子Bcl-3可能对端粒酶活性的调节有正向调节功能。

酵母菌中与端粒DNA连接的蛋白R aPIP对端粒延长的调节有负向调节功能，人的hTRF的功能与RaPIP相似。

端粒酶活性与肿瘤诊断由于发现绝大多数不同组织来源的恶性肿瘤有端粒酶的活性，所以检测肿瘤组织的端粒酶的活性有可能成为恶性肿瘤的诊断指标之一。

研究表明癌组织端粒酶的阳性率很高。

除少数肿瘤外，阳性率均在80%以上，而癌旁组织和相应正常组织端粒酶阳性率一般低于10%。

总体上端粒酶表达与临床特征无明显相关性，但某些组织肿瘤端粒酶活性与其病理学特征相关。

如；脑膜瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤等组织的端粒酶活性随肿瘤组织的恶性程度增加而增加，端粒酶的活性还可能与肿瘤病人的预后有一定的相关性。

另外随着端粒酶的活性检测技术的不断改进和改善，无创性和微创性取样检测端粒酶活性也引起了人们的关注。

在一组膀胱瘤肿瘤组织样品与膀胱冲洗脱落细胞、随意尿中脱落细胞的端粒酶活性的检测结果为98%【41/42】、84[36/43],55%【23/42】,而42例膀胱癌尿脱落细胞学仅有42%检出癌细胞。

对结肠癌的肠冲洗物检测其端粒酶阳性率为60%头颈肿瘤患者口腔冲洗物的端粒酶阳性率为32%此外在乳腺及甲状腺的针吸检测端粒酶的活性的研究中也取得了较为满意的结果。

这些微创或无创方法的应用可能会给临床提供更为有效和适用的参考数据。

端粒酶活性拮抗和与抗肿瘤治疗:由于恶性肿瘤的高端粒酶活性特征一级端粒酶活化与肿瘤发生发展的相互关系，又由于大多数正常体细胞不表达端粒酶活性，使人们认识到拮抗恶性肿瘤细胞的端粒酶活性有可能成为抗癌治疗的新途径。

目前国际国内都在以端粒酶作为靶点，探讨抑制端粒酶活性进行肿瘤的可行性。

Feng 等首先用含有人端粒酶反义RNA的质粒传染Hela细胞，经过23—26代倍增后，Hela 细胞出现生长危机，并伴随端粒缩短和端粒酶活性抑制。

又如，Norton等采用针对
人端粒酶RNA的反义肽核酸（PNA）进行研究，PNA具有较DNA寡核苷酸更高的退火温度以及抗核酸降解能力，还有Kanazawa等设计了一种锤头状酶，具有特异性切割人端粒酶RNA模板区序列的功能。

研究还表明，一些已知的逆转录酶抑制剂，如AZT AraC等有可能对端粒酶活性产生抑制作用。

蛋白激酶C抑制剂对鼻炎癌细胞株NPA-DT6的端粒酶活性具有的抑制作用。

细胞分化诱导剂RA或VitD3在诱导细胞分化过程中均明显的抑制了其端粒酶活性等等。

随着研究的不断深入，新的更有效的端粒酶拮抗剂将会为人们所发现。

但是有几个问题应在拮抗端粒酶活性的研究中引起注意，即除肿瘤细胞外，正常的人类生殖细胞及造血干细胞等也有端粒酶活性，并且是这些细胞正常功能必需的成分，此点应引起研究者的注意。

此外，有些组织的恶性肿瘤表现为端粒较正常组织延长的特性，该类肿瘤不宜采用端粒酶拮抗治疗方案。

端粒酶与肝癌：肿瘤细胞分化的程度和端粒酶的活性也有关系，如在脂肪肉瘤和膀胱癌中低分化增殖指数的端粒酶阳性率高，分化好的阳性率低，说明端粒酶的活性和细胞的生物学行为之间有一定的关系，肿瘤细胞经诱导分化后端粒酶活性可受到抑制。

在过去的几年内，对大多数肿瘤的研究发现端粒酶活性和肿瘤恶性之间的必然联系，使端粒酶成为重要的肿瘤标志物之一。

Shay总结了近3500例有关人类肿瘤与端粒酶关系的文献，评估了端粒酶在肿瘤诊断中的作用。

端粒酶活性在大多数恶性肿瘤组织和细胞株中可以检测到。

如：前列腺、乳腺、结肠、肺、肝，检出的比例在85%~95%。

最今年有很多的学者对肝癌端粒酶表达进行了较多的研究，特别是日本和中国的学者，所有的结果均提示肝癌的端粒酶表达明显高于正常肝组织和肝旁组织，也说明端粒酶是肝癌的标志。

端粒酶活性成为检测肿瘤的一个新的标志物和肿瘤治疗的一个潜在靶点，深入了解端粒酶活性表达的调节控制可以更好地用于肿瘤治疗。

端粒酶和肿瘤之间的关系将在更多的肿瘤中进行验证。

另外，端粒酶和临床诊断与预后的关系，需要在很好设计的前瞻性研究中得到证实。

端粒酶的调节是多途径的，有关端粒酶活性调节的知识可以用来设计通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤。

抑制端粒酶活性是一个高选择性潜在的有效的肿瘤治疗方法，几个物质被证实在体外通过作用于端粒酶而抑制肿瘤细胞增殖，但在体内的作用尚需进一步探讨。

端粒及端粒酶与衰老的关系:关于端粒丢失同衰老的关系理论是由 Olovnikov 博士于1973年首次提出的[11]。

他认为，端粒的丢失很可能是因为某种与端粒相关的基因发生了致死性的缺失。

目前认为，人类细胞内端粒酶活性的缺失将导致端粒缩短，每次丢失50～200个碱基，这种缩短使得端粒最终不能被细胞识别。

端粒一旦短于“关键长度”，就很有可能导致染色体双链的断裂，并激活细胞自身的检验系统，从而使细胞进入M1期死亡状态。

随着端粒的进一步丢失，将会发生染色体重排和非整倍体染色体的形成等错误，这将导致进一步的危机产生，即M2期死亡状态。

当几千个碱基的端粒DNA丢失后，细胞就停止分裂而引起衰老。

端粒及端粒酶涉及衰老最有力的证据是 Bodnar[12]等证实的。

如果细胞试图要维持其正常分裂，那么就必须阻止端粒的进一步丢失，并且激活端粒酶。

Cooke[13]等认为，由于人体细胞中的端粒酶未被活化，从而导致了端粒DNA缩短。

因此，只有那些重新获得端粒酶活性的细胞才能继续生存下去，对于那些无法激活端粒酶的细胞将只能面临趋向衰老的结果。

研究人员最近还发现，患有一种可加速衰老的遗传病人具有异常短的端粒，这进一
步表明端粒在衰老过程中所起的重要作用。

在人类细胞中，研究者还发现，端粒缩短的速率与细胞抗氧化损伤的能力相关。

更容易遭受氧化损害的细胞，其端粒缩短更快，然而那些更能抵抗这种损伤的细胞，端粒缩短得较慢。

如果能减免细胞损伤或激活端粒酶，即可控制人类的衰老进程。

有人曾经对人淋巴细胞的衰老性变化与其端粒长度以及端粒酶活性的关系在各种体内体外环境及处理因素下做了观测，发现端粒酶活性和端粒长度的调节有可能是淋巴细胞增殖的控制因素，这已在人体淋巴细胞的发育、分化、激活和衰老过程中被验证。

曾发现外周血CD+4T细胞的端粒长度在体内随着衰老以及从静息细胞到记忆细胞的分化过程而缩短，在体外则随着细胞的分裂而缩短，这些结果提示端粒长度与淋巴细胞增殖过程以及记忆性增殖潜力相关。

端粒酶的表达已知能够抑制衰老，而Weinberg and colleagues[14]认为端粒酶的作用主要在于延长了端粒悬垂的长度。

细胞的复制期限被认为由最终导致衰老的两个机制决定，一个是累积的DNA损伤，另外一个是端粒的进行性短。

Weinberg and colleagues研究了一个端粒的特殊悬垂结构在衰老过程中的作用，悬垂结构只在富含C的末端之外还有一个由几百个核苷酸组成的富含G的结构。

据称 Shay实验小组[15]的研究策略是通过抑制端粒酶活性，从而迫使永生化细胞转变为正常细胞，进入正常的衰老和死亡模式。

在衰老异常发展中有一种早衰人群，即从20岁开始皮肤和毛发等便迅速衰老，其原因仍在于制造端粒酶的遗传基因。

细胞在分裂的时候，DNA双螺旋结构以其一根长链为“模子”进行 DNA复制。

在DNA修复损伤的时候，“拆解”DNA的双螺旋结构是必要的，制造端粒酶的遗传基因在解开DNA螺旋结构上起作用。

像制造端粒酶并从事DNA复制和修改错误的一类遗传基因，若与延长细胞寿命的端粒酶良好结合，我们也许能期待向“长生不老”的目标进一步接近。

问题和发展：如果端粒酶的激活可以促进肿瘤的形成，那么以端粒酶为靶点，来治疗端粒行为的异常就存在很大的冒险，但是相比之下，端粒的延长，又能稳定基因与染色体，增加组织和器官的再生功能。

为了解决这些问题，就需要研究人员对端粒和端粒酶的结构、功能进行更深入的研究，以便为以端粒酶为靶点的基因治疗提供基础。

人类体细胞在复制衰老过程中产生的端粒丢失现象已在体外得到了证实，而且体内的端粒丢失可作为判断供体年龄的依据。

我们只要设法使已衰老的人体内各种干细胞的端粒长度恢复到年轻时的水平，老人就会返老还童和长生不老。

但在人类端粒及端粒酶的基础研究中，还存在着许多难点，如：人端粒末端的精细结构，端粒的非端粒酶延伸机制；人端粒酶的具体结构及其基因所在的位置；端粒酶的激活机制及其活性调节等，均有待于回答。

尽管如此，我们似乎仍看到了前景的美好。

毕竟人们已找到了同衰老有着紧密相关性的因素——端粒和端粒酶。

人们对于端粒抑制剂的研究已经蓬勃的展开了。

故进一步研究端粒酶的活性调节机制，对于开发新型延缓衰老的端粒酶抑制剂无疑具有重要意义。

Colorado大学的两位研究人员Thomas Cech 和Robert Weinbrg[16]博士已独立地克隆出一种控制人类细胞端粒酶活性的基因。

应用这种基因，很有可能得到一种新的蛋白质——端粒酶的控制剂。

关于衰老机理和抗衰老的研究领域现在仍然是非常活跃的，并将受到越来越足够的重视，因为它对于延缓衰老，实验老年医学研究的目的即防止人类早衰，保持
人体健康长寿是极为重要的。

但是，就目前人类在这方面的研究来看还很薄弱。

在今后一个时期内，有关衰老与抗衰老的研究重点还应放在以最新生物学技术研究有关长寿与衰老基因的克隆、结构分析以及对这些基因的调控机制；机体衰老过程中自由基、突变以及其它有害刺激因素启动细胞衰老凋亡的分子机制和这些过程被调控的分子机理；利用衰老基因与长寿基因的研究成果进行的基因治疗方面研究等。