环境生物学 第七章

确定半数致死量（LD50）
试验结果
• LD50值越小，毒性越大。 • 急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不 能全面反映其毒性。 • 由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不 一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。
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亚慢性毒性试验和慢性毒性试验
亚慢性毒性试验和慢性毒性试验 蓄积毒性试验 • 蓄积系数法（Cumulative Coefficient Method）：用 来评价环境污染物蓄积作用的方法。
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3.1 生物测试及方式
生物测试（Bioassay）的概念： • 指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或 环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。
• 注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、 器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的 反应。 • 注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前 者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能 测定污染物的浓度。 • 例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各 种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有 利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒 性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所 应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。 2
半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50）
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急性毒性试验（Acute Toxicity Test）
概念 研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多 次染毒动物所引起的毒性的试验。 其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特 点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计 依据。
急性毒性试验类型 • 哺乳动物急性毒性试验 • 水生生物急性毒性试验 • 蚯蚓急性毒性试验
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动物急性毒性试验（1）
动物急性毒性试验方法如下：
按试验要求选择受试生物
常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先 观察几天后标记编号并随机分组。
预备试验和确定剂量组
选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90％（或全部） 死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10％死亡（或 不死亡）的剂量（即最低剂量组剂量）。 在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数 插入若干个中间剂量（一般4～6组），从而确定正式试验的 剂量组。
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3.4 生物致突变、致畸和致癌效应检测
3.4.1致突变效应
基本概念
• 突变（Mutation） • 基因突变（Gene Mutation ）和染色体畸变（Chromosome Mutation ） • 致突变作用（Mutagenesis）和致突变物（Mutagen）
致突变试验的目的
• 为了确定受试物对生物体是否具有致突变作用。
• 蓄积系数K＝
LD
50(n)
LD50(1)
• 生物半减期T1/2＝
(t 2 t1) log 2 log y1 log y 2
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3.3 生物的分子和细胞水平检测
加合物的测定 • DNA－加合物的测定 • 蛋白加合物的测定 一般代谢酶的活性测定 • 乙酰胆碱酯酶 • 腺三磷酶 解毒系统酶类诱导作用的检测 • 混合功能氧化酶的诱导作用 • 谷胱甘肽硫转移酶 抗氧化防御系统检测 • 过氧化氢酶 • 谷胱甘肽过氧化酶
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3.4.2 致畸效应
概念 • 畸形（Malformation）、畸胎（Terate） • 致畸作用（Teratogenesis）、致畸物（Teratogen） 致畸作用的毒理学特点 • 胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而 呈现不同的敏感性。 • 种属差异较为明显。
受试生物的选择 多数来自于野外采集。 影响生物测试结果的因素 • 受试生物 • 试验条件 • 实验室差异
生物测试的标准化
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3.2 一般毒性试验
基本概念 毒物（Toxicant）
毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物 质只有达到中毒剂量时才是毒物。
中毒（Intoxication） 中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、 亚急性中毒、慢性中毒。 毒性（Toxicity） 指一种物质引起机体损伤的能力。 毒性作用或毒效应（Toxic Effect）
生物测试的分类
水污染生物测试（毒性试验） 大气污染生物测试（植物人工熏气） 静止式生物测试 流动式生物测试 短期生物测试
中期生物测试 长期生物测试
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易挥发、不稳定、代谢速率 快、BOD高：采用流动式
短期生物测试（Short Term Bioassays） 主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染 物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的 相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的 相对敏感性等。多数采用静止式。
剂量－效应关系和剂量－反应关系 • 以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示 反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲 线，即为剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线。 • 不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与 效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线。 （见图3－1，3－2，3－3，3－4）
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法
• 方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测 其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的 营养缺陷型突变菌株（his－），回复为能自行合成组氨酸的 （his＋）菌落数。 • 突变率＝诱发回复突变菌落数 / 自发回复突变的菌落数（对照） • 当突变率大于2.0时，为阳性结果。
毒性试验常用参数
致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， Lethal
Concentration）
• • • • 绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（LD50、LC50） 最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0 ）
最大无作用剂量（Maximum No－effect Level）
致突变试验方法
• 基因突变试验，例如Ames试验，下文以鼠伤寒沙门氏菌/哺乳 动物微粒体酶试验法为例介绍。 • 染色体畸变试验 • DNA损伤试验
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Ames试验
Ames试验原理
• 同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化 学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重 新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。 • 注释1：营养缺陷型突变型菌株 • 注释2：野生型微生物
• 每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake） • 最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）
毒作用带
• 急性毒作用带（Acute－toxic Effect Zone） • 慢性毒作用带（Chronic －toxic Effect Zone ）
第三章 污染物的生物效应检测
本章将讨论以下内容: 生物测试及方式 一般毒性试验 生物的分子和细胞水平检测 生物致突变、致畸和致癌效应检测 微宇宙法
本章重点
① ② ③ ④ ⑤
生物测试及其基本类型； 有关毒性及其参数的概念； 动物急性毒性试验的程序； 致突变、致畸效应、致癌效应的概念； 微宇宙法的概念及其设计。
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致突变试验设计II
国际协调组织(ICH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建
议的检测试验组合为
• ①细菌基因突变试验； • ②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比 试验； • ③体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试 验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。 • 在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时， 其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和 重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为 阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关 系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴 性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在 三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明 确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为 了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或 应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、 DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变 检测)。 18
染毒方式和受试物的配制
一般用灌胃法和人工熏气法。 受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依 次稀释到所需浓度。
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动物急性毒性试验（2）
观察指标
中毒症状：一般观察24～48小时，最好观察到绝大多数动物 出现典型中毒症状。 动物死亡数目和死亡时间 病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡 原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。
致ห้องสมุดไป่ตู้变试验设计III
我国卫生部在《食品安全性毒理学评价程序》
(1994)中对遗传毒理学试验的要求是：
• 根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点 的不同，并兼顾体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原 则，在Ames试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变 试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项， 如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞 HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试 验，UDS试验)中再选择两项试验进行。 • 我国《农药安全性毒理学评价程序》(1991)中对遗传毒理学试 验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细 胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸 变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还 需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、 果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。
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致突变试验设计I
美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，
把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。
• 第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳 动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验 或染色体畸变试验)； • 第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用； • 第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。 • 在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学 物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞 的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显 性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异 座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染 色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死 试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位 试验。
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效应（Effect） 也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生 的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用 一定的计量单位表示。
反应（Response） 指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定 强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言 的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。
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剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线图
反应强度（％） 死亡率（％） 剂量 图3－1剂量－反应曲线（直线型） 100
100
50
50
剂量
图3－2 剂量－反应曲线（抛物线型）
死亡率（概率单位） 100
死亡率（％）
100
50
50
剂量 图3－3 剂量－反应曲线（S形线型）
对数剂量 图3－4 剂量－反应曲线
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中期生物测试（Intermediate Term Bioassays） 时间为8d到90d，多数情况下为流动式。 长期生物测试（Long Term Bioassays） ∆ 包括全部生活史的生物测试（Complete Life－cycle Bioassays）和部分生活史的生物测试（ Partial Life－ cycle Bioassays ） ∆ 目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒 物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC） ∆ 只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界 的季节变化相符合。 4