多酚氧化酶活性测定

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定

一、目的

通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下：

多酚氧化酶

邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O

2——————→ 邻醌＋H

2O

三、材料、仪器及试剂

1.材料：

马铃薯块茎等

2.仪器：

UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3.试剂：

聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1pH 6.5磷酸缓冲液；0.1mmol·L－1－1

pH6.5磷酸缓冲液；0.05mol·LpH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1－1

mol·L儿茶酚；

20％三氯乙酸。

四、实验步骤

1.粗酶液的制备

称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml0.01mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2.活性酶的测定

在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～

2min内测定吸光度变化（A）值。

五、酶活性的计算

以每min内A

525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

A 酶提取液总量（ml）

酶活力（0.01A·min－1）＝

———————×———————————

0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）

A

酶提取液总量（ml）

酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)=————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）

公式中：

A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。