人工培养细菌

细菌的人工培养

人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。

一、培养基的制备原则：

1、必须有充足的营养。

2、合适的酸碱度。

3、绝对无菌。

二、培养基的制备

培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。

按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。

以下介绍常用基础培养基的制备。

（一）肉汤培养基：

制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。

制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2

肉汤培养基常用于增菌培养。

（二）肉汤琼脂固体培养基：

在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。

普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。）

（三）肉汤琼脂半固体培养基：

在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。

半固体培养基用于检查细菌的动力和细菌菌种的保存。

三、常用培养基介绍

（一）基础培养基

基础培养基含有大多数细菌生长繁殖时所需要的氮源、碳源、无机盐类、水份等最基本的营养成份，可供大多数细菌生长，并可作为营养、鉴别及选择培养基的基础原料。常用的如肉汤培养基。

（二）营养培养基

在基础培养基中添加一些其他的营养物质，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生长因子等，可供培养营养要求较高的细菌。例如血琼脂平板、血清肉汤培养基等。

（三）鉴别培养基

利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物，观察细菌在其中生长后分解底物的作用，从而鉴别和鉴定细菌。例如，单糖发酵管就是在无糖的基础培养基（蛋白胨水）中加入某种糖类及指示剂，因不同细菌对各种糖类发酵作

用不同而鉴别之。

（四）选择培养基

在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某一类细菌生长，而有利于另一类细菌生长，从而将后者筛选出来，常用在含有杂菌的标本中分离某种致病菌，例如SS琼脂平板。

（五）厌氧培养基（见实验十-厌氧性细菌，P.80）

四、细菌的接种技术和培养方法：

一般细菌都可用人工方法进行培养，以进一步研究它们的各种生物学特性。培养细菌时，根据研究目的和细菌生长条件的差异，需采用不同的接种技术和培养方法。

（一）细菌的接种技术

接种技术一般分为分离培养接种法和纯种细菌接种法，正确的接种技术是获得典型的生长良好的细菌培养物所必需的。

1、分离培养接种法---平板划线法：

被检材料如粪便、痰、脓汁、尿液、脑脊液等常混杂有多种细菌，平板划线法可使混杂的细菌在琼脂平板表面分散生长，各自形成不同的菌落，再根据菌落的形态特征，挑选单个菌落继续培养，以此分离获得纯种细菌，用于进一步研究、鉴定或保存。

平板划线的方法根据待检标本中细菌的数量来选择，可分为平行划线法和分区划线法两大类。

【材料】葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液、普通琼脂平板。

【方法】

（1）平行划线法：常用于含菌量较少的标本。

①烧灼接种环，待冷，取一接种环菌液。左手斜持平皿（450角），用拇指打开皿盖，使

其与皿底间分开成2～3cm宽的缝隙，靠近火焰周围，右手握持沾菌之接种环伸入皿内，在平皿上端1/6范围来回划线，密集涂布。

②烧灼接种环，待冷后（是否冷却可在平板培养基边缘无菌处接触一下，若琼脂溶化表

示尚未冷却），通过原划线处作连续平行划线（如图2-1A）。划线时使接种环与平板成300～400角，轻触平板，用腕力将接种环在平板表面行轻快的滑移动作来回划线，划线间距适当，不能重叠，接种环也不能嵌入培养基内划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。

③接种完毕后，盖皿盖，将接种环火焰灭菌后放回，用记号笔在皿底玻璃上注明标本名

称，接种者班级、姓名、日期等，将培养皿倒置（平皿底面朝上，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下），送进温箱。

④经37℃18～24小时孵育后取出，观察琼脂平板表面细菌生长情况，注意菌落的特征。

（2）分区划线法：用于含菌量较多的标本。

同上法通过原划线处作连接平行划线，划线范围占平板的1/3～1/5；种毕, 旋转平板，接种环用火焰灭菌，冷却，再通过前一段划线在平板另1/3～1/5面积内作连续平行划线；

如此重复3～5次（如图2-1B和2-1C）。

接种完毕后，盖皿盖，接种环火焰灭菌后放回。同上在皿底玻璃上注字后，将培养皿倒置，送进温箱培养，37℃18～24小时后取出，观察菌落特征。

2、纯种细菌接种法

细菌分离成纯种细菌后，常需接种至各种有关培养基，以扩大繁殖，做进一步鉴定。根据培养基的物理性状，纯种接种法有斜面培养基接种法，液体培养基接种法和半固体培养基接种法三类。

【材料】葡萄球菌或大肠杆菌18～24小时斜面培养物各一支、固体琼脂斜面培养基、