MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞

知识总结

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小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％DMEM

10％FBS

1％NEAA

1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM (Gibco # 12100-046)

10% FBS (Gibco # 16000-044)

1% NEAA (Gibco # 11140-050)

MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM

20% FBS

1% NEAA

冻存培养基：

60％DMEM

30％FBS

20％DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO 的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。

注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials

注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the c ap.

3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。

6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。