核酸适配体

基于适配体的生物传感器是用适配体作为识别元件来特异 性地检测其相应的靶物质。
目前适配体生物传感器（Aptasensors）尚处于起步阶段。 Chunyan Yao等将IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传 感器阵列，建立了适配体压电石英生物传感器模型，用于 特异性检测标准溶液和人血清中的IgE。该方法最低可在标 准和人血清溶液中分别检测出2.5-200 ug/L的IgE，整个检 测时间只需15 min，而且固定在金膜表面的适配子在反复 洗脱后并不影响其灵敏度。
Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、 高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)。他 们将凝血酶aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂， 凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素 与猝灭剂相互靠近发生能量转移而观察不到荧光；在结合 凝血酶后aptamer分子构象改变，致使MAB的荧光素与猝灭 剂分开从而可以检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度的
然后，通过PCR或RT-PCR筛选条件的不断提高，与靶目标高度特意结合的DNA或 RNA分子呈指数增长，而亲和力低的序列逐步被淘汰，直
筛选流程图
核酸适配体筛选中的分离方法
用SELEX技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合靶 分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。主要分离方法有： 毛细管电泳 超滤离心膜分离法 硝酸纤维素膜分离法 亲和介质分离
利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现
离子是一了种对重铅要和的汞生的理同指时标测离定子，维持着细胞的正常功能，参与多种新陈代谢过程鍄与 有密切关系。钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 G-quadruplex 二级构型 的稳定作用，因此可以通过监测 核酸适配体二级结构信号的变化临床应用
2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加 他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科 疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变 （Age-Related Macular Degeneration， AMD）患者的视力缓慢丧失。
Macugen是一种选择性血管内皮生产因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）拮抗剂。
测 定(见图 3) 。Choo 等人开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器，利用核酸适配体 现了对汞离子的高灵敏快速检测 ，检测 限可达 10pmol/L[15]。
图 3 核酸适配体同时检测 Hg2+和 Pb2+示意图 Fig.3 Schematic representationof simultaneous detection of Hg2+ and Pb2+ using aptam
亲和介质分离
一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、 纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。
如J.Colin Cox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌 酶适配体的自动化筛选。具体流程为：通过链酶亲和素与 生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。 随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设 定的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进 行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了 不到两天的时间就完成了12轮的筛选。
Aptamer巨大的应用前景
APTAMERS: AN EMERGING CLASS OF THERAPEUTICS （.Annu. Rev. Med. 2005. 56:555–83）
Analytical Applications of Aptamers(Andrew D. Ellington .Annual Review of Analytical Chemistry (2008). Volume 1, Jul 2008)
自然界中Aptamer存在的证据： Riboswitches
Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression
核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家 Ronald Breaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果 启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配 体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结 构元件。
核酸适配体的应用
核酸适配体在分析化学中的应用 核酸适配体与疾病诊断和新药研发
核酸适配体在分析化学中的应用
靶物质的分析与检测
该方面应用的基本思路是将各种报告基团，如荧光试剂， 定点标记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使 aptamer与靶物质发生相互作用，再通过对报告基团的信号 检测实现对靶物质的定性检测或定量分析。
离子 优先结合,而带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的 一种高毒性并金分纳布米广粒泛子的的污聚染集物,从，而在颜鱼色类由及红贝类变中蓝常实常现以比甲色基法汞测的定形式存在。汞 危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸系统、皮肤、血液及 ng 等人利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现
核酸适配体的化学本质与识别 机理
核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单 链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下， 它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键 作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
APTAMER
适配体
Aptamers
(from the Latin aptus - fit, and Greek meros - part)
核酸适配体（Nucleic Acid aptamers） 多肽适配体（Peptide aptamers）
什么是核酸适配体？
核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合 的，人工合成的核酸。它可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为 25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶 分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别 能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋 白、细菌、病毒、细胞和组织等。
超滤离心膜分离
超滤离心膜有两部分组成，一部分为滤膜滤芯．另一部分 为套管，进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液 体加在滤芯上．通过高速离心将不与靶标结合的游离寡核 苷酸滤掉，将与靶标特异性结合的ssDNA留在超滤离心膜 上。超滤滤离心膜在SELEX技术中的应用可以满足分离要 求，而且操作简便。
SELEX筛选流程
首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性 的适配体并以此确定具体的苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之 后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´ 端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要 的T7 RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后， 将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。
生命活动的基础是什么？-Binding!
如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那 我们就向证明"RNA起源说"迈出了一步。
1990年，两个研究组几乎同时用T4 DNA polymerase与几种有 机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种 RNA叫做aptamer。
核酸适配体的筛选策略
核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) ）来 完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基 本原理就是就是利用分子生物基(aptamer) ，经反复扩增、筛选数个循环，即 可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。
核酸适配体概念的提出
1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化 作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。
支持RNA为生命起源假说的可能证据：
如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生 物；
如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能 性RNA的"痕迹"；
如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生 命活动的RNA序列。
蛋白质检测
Lindner等发展了一种基于aptamer芯片的蛋白质检测方法， 将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体分别固定在芯 片上，然后将IgE与其温育，发现aptamer对IgE的特异性和 敏感性比IgE抗体更好。该方法对IgE的检测限达到10ng/ml。
Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识 别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一 芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸 aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地 检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋 白质组学研究的发展起到重要作用。
毛细管电泳
毛细管电泳的原理是基于不同 组间荷质比差异导致的电泳迁 移率不同而进行分离，在电场 中，待分离组分在50~75μm内 径的毛细管中因荷质比差异导 致不同的迁移速度而得到分离， 当靶分子与其aptamer亲和作用 足够强,形成的复合物足够稳定 时，在合适的分离和检测条件 下，可分别得到游离的寡核苷 酸与复合物的电泳峰。
1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分 子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折 叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。
1Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249:505–10； 2 Ellington AD, Szostak JW. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specificligands. Nature 346:818–22
带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集，从而颜色由红变蓝实 出限可达 5.3ppb[13]。
图 2 核酸适配体用于 As3+的检测 示意图 F针ig.对2.S三ch价em砷at的ic核rep酸re适sen配ta体tio在no三f d价ete砷cti离on子of存A在s3+的us情in况g a下pta与m砷er
经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲 和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值 多在pmol/L-nmol/L之间。
Structure of an RNA aptamer specific for biotin. The aptamer surface and backbone are shown in yellow. Biotin (spheres) fits snugly into a cavity of the RNA surface