绿色荧光蛋白

荧光鱼宠物
• 2003年，荧光蛋白首次被应用到商业领域是从美 年 国约克镇的家庭宠物荧光鱼开始的， 国约克镇的家庭宠物荧光鱼开始的，除加利福尼 亚州外可以在美国的任何一个州买到这种荧光鱼， 亚州外可以在美国的任何一个州买到这种荧光鱼， 但部分环保人士担心它可能对生态环境造成危害， 但部分环保人士担心它可能对生态环境造成危害， 为此呼吁联邦政府应加强相关的监管。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作 为基因治疗检测指标 为基因治疗检测指标 。 在应用中还发现有许多问题 问题亟待解决 但是 ,GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 : (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 , 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 (2) 多数生物具有微弱的自发荧光现象 , 并有着类似 多数生物具有微弱的自发荧光现象 的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 可能与 稳定细胞株, GFP 参与细胞凋亡过程有关 参与细胞凋亡 细胞凋亡过程有关
绿色荧光蛋白兔子
• 荧光蛋白质具有艺术感的 转基因动物当属最为著名 的“绿色荧光蛋白兔子”， 2000年由爱德华多-卡茨 创作的艺术作品，它是一 只在法国实验室培育的、 被命名为“阿尔巴” 转 基因兔子，但是世界各地 的争议也接踵而至。
绿色荧光猪
• 这是中国东北农业大学绿 色荧光猪，这些猪不是直 接进行基因工程改造的结 果，而是遗传它们转基因 猪妈妈的荧光基因。这表 明转基因克隆猪的一些性 状能够保持稳定遗传，不 存在生理缺陷。
绿色荧光蛋白的推广——马丁-查尔 菲
• 1993年，马丁·查尔 年 马丁 查尔 菲成功地通过基因 重组的方法使得除 水母以外的其他生 如大肠杆菌等) 物(如大肠杆菌等 如大肠杆菌等 也能产生绿色荧光 蛋白， 蛋白，证实了绿色 荧光蛋白与活体生 物的相容性。 物的相容性。
GFP第一次成为荧光指示剂
不同的突变体给应用提供了更广阔的前景 , 但是 也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显 示了更大的敏感性。 示了更大的敏感性。 敏感的 研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细 胞质、细胞核、 胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值 , 发现在这些区域测量到的数值与以前报道的 测量值有非常好的吻合 。
四 应用前景
野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程 形成正确构象后才有功能 , 而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。 • 为了改善 GFP 荧光特性 ( 如摩尔吸收值及 释放波谱 ) , 对 GFP 进行了突变和重组实 验。 • Chalfie 等 通过测定大肠杆菌和线虫体内 重组 GFP 的荧光光谱发现 , 它和提纯的天 然 GFP 光谱完全一致。
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到目前为止 , 荧光蛋白已有非常广泛的应用 , GFP 可应用于 转染细胞的确定 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位 细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析 核酸碱基探针分析 分子间第二信使钙离子 cAMP 水平的指示 细胞间隙pH 变化的检测 。
谢 谢
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• 突变实验发现 , 多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性 , 但某种突 变使 GFP 明显地改变激发和释放波 谱。 • 例如用 The 替代Ser 65 , 在 490 nm 处出现一个单一激发峰值 , 激发后产 生的荧光强度是野生型的 6 倍 , 对光 淬灭具有更强的抵抗性 , 并且出现红 移现象 , 该突变蛋白质与 FITC 的性 质相似 ; • 同样 Leu 替代 Phe 64 , 即增加 GFP 的可溶性 , 荧光强度增强 35 倍。
荧光老鼠
• 这是第一个在黑暗 中发光的哺乳动 物——荧光老鼠， 1997年在日本大阪 大学诞生。研究人 员利用荧光老鼠研 究胎儿的生长发育。
转基因荧光猫
2007年韩国研究人员通过 对母猫的皮肤细胞进行基 因改造，用转荧光蛋白基 因技术克隆出转基因荧光 猫，在黑暗中发出红光， 这标志着全球首次克隆出 带红色荧光蛋白基因的猫， 这项技术将有助于研究治 疗人类遗传性疾病和发展 干细胞研究和治疗。
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随着病毒在宿主体内不断扩散， 随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟 踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径， 踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径，或者你把 它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细 胞内部的移动
科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细胞 的发育过程。 的发育过程。
在动物方面的应用
大脑彩虹图
• 发现绿色荧光蛋白之后，科 学家又发现了其他颜色的荧 光蛋白，可以同时追踪多种 蛋白质。 • 美国哈佛大学杰夫-利希曼 （Jeff Lichtman）等科学家 多种颜色荧光蛋白基因转移 绘制了大脑神经网络彩虹图， 有利于对大脑工作方式进行 更深入研究。颇具美感的大 脑彩虹图获得了2007奥林巴 斯生物数字成像大奖。。
GFP结构
荧光蛋白发光的原理
• 荧光：光子从高能级落到低能 级时发出荧光； • 特点：荧光物质经某种光的照 射后发出荧光的能力降低。
不同属的水母体内荧光蛋白发光机制
荧光蛋白发光与萤火虫发光有什么 联系吗?
• 根据科学家的研究，萤火虫的体内含有一种磷化 物——发光质，发光质在体内如经发光酵素的作 用，会引起一连串的生化反应，而萤火虫的光就 是这些反应之后的副产品。萤火虫的光为冷光， 不会让人有灼热的感觉。 • 生物学家发现，萤火虫尾部的白色排状部位就 是它发光的位置，称作「发光器」。布满含磷的 发光质及一种发光酵素。
• 3 个氨基酸同时突变时 , 在 360 nm 至 400 nm 之间 , 出现最大激发峰 , 而且增大生色团形成的机率 , 可溶 性更强 , 荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。
• 现有人认为 , 低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一 , 为此 , 研究人员合 成了高 GC 含量的特殊 GFP , 并且发现 这种 GFP 有更强的荧光强度 。 • 此外 , 用人蛋白质中偏爱的密码子替代 相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。 • 许多 GFP 突变蛋白 , 不仅改变了激发 和释放波谱 , 而且提高生色团形成的效 率、溶解度、蛋白质表达等
三 绿色荧光蛋白的应用 • 在植物方面的应用
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• 分子标记
作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学 的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋 白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标 签(protein tagging)，即利用DNA重组术， 将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染 合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜 便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
• 其基因所产生的蛋白质，在蓝色 波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，称 为绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)， 简称GFP。 • 这个发光的过程中还需要冷光蛋白质 Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离 子(Ca2+)可产生交互作用。 • 绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定， 对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因
萤火虫有专门的发光 细胞，在发光细胞中 有两类化学物质： • 一类被称作荧光素 （在萤火虫中的称为 萤火虫荧光素）。 • 另一类被称为荧光素 酶。
叶绿素和绿色荧光蛋白的发 光原理一样吗?
• 叶绿素的提取液在光下会发出红色 荧光,因为叶绿素在光下接受电子会 迅速从基态窜升至激发态,虽然还会 马上回落成基态,但这个过程中会有 90%的能量以热能的形式散失掉,并 用剩余的10%左右的能量发出红色 的荧光.
• 进行了大刀阔斧的化 学改造， 学改造，不但大大增 强了它的发光效率， 强了它的发光效率， 还发展出了红色、 还发展出了红色、蓝 色、黄色荧光蛋白， 黄色荧光蛋白， 使得荧光蛋白真正成 为了一个琳琅满目的 工具箱， 工具箱，供生物学家 们选用。 们选用。
•
除了让绿色荧光蛋白变得更加完美，钱 永健等人还用它做模板，先后变出了蓝色 系列、青色系列、黄色系列、橙色系列的 荧光蛋白。再后来，一些科学家从一种海 葵中分离出了红色，人们亲切地将其衍生 出的红粉系列命名为草莓、樱桃、甜瓜、 香蕉、橙子、梅子和覆盆子。至此，荧光 蛋白终于能在细胞中画出一道完整的彩虹。
• GFP 依赖的 pH 检测子 , 与小分子染料不同 , 这 种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系 列问题 , 且 GFP 具有高度选择定位性 , 适合于所 有对于基因转染敏感的细胞。 • 更重要的是 , 这个实验说明利用组织特异性启动 子GFP 检测特定组织 , 通过融合到目的蛋白 , 可 以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内 区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到 达部位 pH 值的可能性。
主讲人： 主讲人：靳阳涛 程龙 夏远洋 杜玉苹 李香菊
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• 一 基本介绍
• 二 绿色荧光蛋白发现与发展过 程 • 三 绿色荧光蛋白的应用 • 四 应用前景
一 基本介绍 什么是绿色荧光蛋白？
• 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发 光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基 酸构成，第65～67位氨 基酸(Ser-Tyr-Gly)形成 发光团，是主要发光的 位置。其发光团的形成 不具物种专一性，发出 荧光稳定，且不需依赖 任何辅因子或其他基质 而发光。
1994年，马丁·沙尔 年 马丁 沙尔 菲弃用侧翼序列， 菲弃用侧翼序列，而 用PCR方法扩增了其 方法扩增了其 基因的编码区， 基因的编码区，将他 转移到载体中， 转移到载体中，通过 UV或蓝光激发，在 或蓝光激发， 或蓝光激发 细胞内产生了美妙的 绿色荧光。 绿色荧光。
绿色荧光蛋白的改造——钱永健
• GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记 的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用 于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧 光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度 可能低于某些酶类报告蛋白。 • 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧 光的产生不需要任何外源反应底物，因此 GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其 作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
GFP性质
• GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP 抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光 波长下更稳定。 • GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还 原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦 重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立 即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响 GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也 不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或 甲醛等。
二
绿色荧光蛋白的发现——下村修 下村修 绿色荧光蛋白的发现
• 1962年首先从
水母中分离绿色 荧光蛋白的科学 家，他发现这种 蛋白在紫外线光 中呈现亮色。
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1974年，第一次 获得GFP。
下村修和约翰逊终于 得到了GFP结晶，当 时即命名为绿色蛋白， 后来成为绿色荧光蛋 白。
1992年，道格拉斯 普瑞金拿到了绿色荧光蛋 年 道格拉斯·普瑞金拿到了绿色荧光蛋 白的基因 GFP的首次克隆合并测 序 1992年，道格拉斯普瑞舍克隆并测序 了新生型的GFP， 文章发表在Gene杂 志上。