基因工程技术及应用.

二、基因工程操作步骤
包含以下步骤： 获得目的基因 构造重组 DNA 分子 转化或转染 基因表达(蛋白质产物的分离纯化)
目的基因的筛选和分离的方法： ①直接从染色体DNA中分离：仅适用于 原核生物基因的分离，较少采用。 ②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸 顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序 再进行人工合成。适应于编码小分子多肽 的基因。
喷洒工程菌清除石油污染
⑤利用基因工程培育新型微生物
基因表达
重组 DNA 分子进入寄主细胞后， 其中的目的基因能否表达，表达效率高 低，还有很大差别。表达通常是指目的
基因编码的蛋白质合成。
基因工程的最后一步，是把所获得
源自文库
的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。
生物反应器
三、基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、农业 等各个领域得到了广泛的应用。
医学上的应用
从mRNA合成cDNA:采用一定的方法钓 取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催 化合成其互补DNA（cDNA)，除去mRNA 后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA， 从而得到双链DNA。
④从基因文库中筛选： 基因文库： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断 后，与载体DNA重组，再全部分别转化宿主细胞， 得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库 (genomic DNA library)。 方法：将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成 cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因 的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有 组织细胞特异性。
基因工程药物：基因工程被用于大量生产 过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－ 肽类药物（胰岛素、干扰素）。 用于疫苗生产：基因工程疫苗不含病原物 遗传信息，无感染性危险。 用于基因治疗
工业中的应用
生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。 现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝 乳酶，大量用于奶酪制造。 哺乳小牛 胃 凝乳酶 凝乳酶基因 转入啤酒酵母 凝乳酶
转化/转染
转化：以质粒作载体将质粒导入受体细菌。 转染：若质粒、病毒作为载体将重组子导入 动/植 物细胞，或以噬菌体作为载体将重组子 导入细菌细胞。
受体细胞必须处在感受态才能接受外源性 DNA。用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透 性。
重组DNA的筛选和鉴定
• 可采用以下方法进行： • 根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药 基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行 筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四 环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因 后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉 素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素 的培养基上能够生长，而在含四环素的培养 基上不能生长的细菌即为带重组质粒的细菌。
载体和目的基因的重组
• 将带有切口的载体与所获得的目的基因连接 起来，得到重新组合后的DNA分子。
• 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行 切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如 将载体与目的基因混合在一起，二者即可通 过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶， 即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况 下，对产生的平端也可直接进行连接。
制造奶酪
转基因动物和植物
转基因动物首先在小鼠获得成功。现 在转基因动物技术已用于牛、羊，使得 从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称 为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播种。
④工程菌在环境工程中应用
美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解 能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污 染。
根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种 基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法 筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应 的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因 的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。
根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的 含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进 一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取 其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶 切，再将其与不含目的基因的载体一起进行 电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的 电泳带即证明重组体中带有目的基因。
•从基因文库中筛选目的基因常采取“钓”的 办法，即印迹法。
⑤利用PCR合成： 如已知目的基因 两端的序列，则 可采用聚合酶链 反应 （Polymerase chain reaction， PCR)技术，在 体外合成目的基 因，但此方法主 要用于目的基因 的扩增。
载体和目的基因的切断
• 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶。 • 由限制酶切断后的末端可形成平端、3‘突出粘性末端和5’-突出粘性末端 (cohesive end)三种情况。 • 相同限制性内切酶切割目的基因和载体 DNA形成粘性末端互补，便于连接。 • 限制酶目前已经发现3600多种，所识别的 顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。
基因工程技术和应用
一、基因工程技术概述
基因工程是生物技术工程的核心部分。
生物工程技术: 基因工程、蛋白质工程、微 生物工程、酶工程、细胞工程等工程技术
基因工程(genetic engineering) —— 实现基
因克隆所用的技术方法及相关工作称基因工程，也 称重组DNA技术.或重组DNA工艺学。
定义：基因工程是指将外源目的基因（一段 DNA片段）组合到载体DNA分子（质粒，噬 菌体或病毒等）中去，再使它转染进入受 体细胞（亦称寄主细胞），在受体细胞中 外源基因得以增殖和表达，从而得到期望 的由这个外源基因所编码的目的蛋白质。
目的： ① 分离获得某一有用的基因或DNA ② 获得有用的基因表达产物（蛋白质）