康乃馨的离体快繁开题报告

康乃馨的离体快繁开题报告

学生姓名：姜平阳张骏驰李凯

班级：14生本2

专业：生物技术

学部：生物医药

指导教师：严铮辉

二〇一七年三月

一、实验目的

掌握植物离体快速繁育原理、方法和完整过程。

二、实验原理

康乃馨又名香石竹,花色艳丽,开花时间长,装饰效果好,是世界上最畅销的切花之一,具有较高经济价值。由于病毒病侵害,常使植株矮化,花朵变小,花色产生斑点,退色甚至不开花,影响切花产量和质量。通过茎尖分生组织培养,能够获得“无病毒”的健康植株,对于引进的少而新的脱毒种苗,再进行一次茎尖培养,进一步降低基础苗中的病毒含量,并通过组织培养的方法快速繁殖,在短期内,就可以获得大量的脱毒试管苗,使引入材料迅速在生产上推广应用,取得明显的经济效益。

三、实验仪器与材料：

1.材料康乃馨枝条

2.仪器设备

超净工作台，带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水

培养基MS+1mg/L 6-BA

剪刀，镊子

量筒，酒精灯，滤纸，蒸馏水，小刷子

纱布，棉塞，牛皮纸，标签纸，肥皂，酒精喷壶

3.试剂

95%乙醇，70%酒精，70%酒精棉球

四、培养基的配方

（1）香石竹的生芽培养基

MS+ IAA (0.1mg/L) + BA( 2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂(8g/L)，pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10~15瓶。

另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3~4瓶，，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。

（2）香石竹的继代培养基

MS+ BA( 0.3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂(8g/L),

pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10-15瓶。

另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3-4瓶，，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。

（3）香石竹的生根培养基

MS+生根培养基为1/2MS+NAA(0.075mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂

(8g/L)，pH5.8-6.0,配制0.3L,用小培养瓶分装10-15瓶。

另外，需要制备无菌水20瓶（大培养瓶），每人3-4瓶，纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。

五、实验步骤

1.灭菌

（1）实验室及超净台消毒

先进行无菌室内消毒，用紫外线照射30-45分钟，地面消毒，紫外灯关闭约20min后方可进去工作。对超净工作台进行消毒，开启无菌风开关，开启紫外，让无菌风吹上15-20min后方可工作。并用70%的酒精棉台擦净工作台

（2）外植体灭菌

取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗30-60s，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间）。用0.2%的次氯酸钠溶液浸泡10-15min,再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。

2.接种

接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在标签纸上写明材料、日期、实验人姓名，并将标签贴在相应试剂瓶上。

3.培养条件 25℃光照13h/天，光照1000lx。

4.继代培养：

（1）无菌操作准备

将培养基及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯，照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。洗手，用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，镊子、解剖刀、剪刀等接种工具灼烧灭菌，待冷却后使用。

2）无菌操作接种

酒精灯火焰旁打开香石竹芽苗培养基，用镊子取出香石竹芽苗，置于无菌培养皿，用解剖刀将芽苗簇切割成含2~3芽苗，然后切去芽

苗的上端。

（3）培养

将培养瓶表面用酒精擦拭消毒，置于培养室进行光照培养。整理、清洁超净工作台。

（4）观察记录

定期观察培养情况，包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。

5.诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6培养基诱导

（1）无菌操作准备

将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯，照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。洗手，用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，镊子、解剖刀、剪刀等接种工具灼烧灭菌，待冷却后使用。

2）无菌操作接种

酒精灯火焰旁打开香石竹培养瓶，用镊子取出香石竹芽苗，置于无菌不锈钢碟子，用解剖刀将芽苗的每个小芽分开。

用镊子将单个小芽插入生根培养基，每瓶接3个。盖上瓶盖，贴上标签，注明材料名称、接种日期和姓名。

（3）培养

将培养瓶表面用酒精擦拭消毒，置于培养室进行黑暗培养。整理、清

洁超净工作台。

（4）观察记录

定期观察培养情况，包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。

6.试管苗移栽

（1）缓苗移栽

试管苗在移栽前几天一般都需要进行炼苗，让它有个逐步适应环境的过渡阶段，一般方法是先将培养瓶从培养室拿到常温下放置，然后将试管苗容器口上包扎的塞子或纸去掉放置几天，此时需注意保持空气湿度，并防止杂菌污染，尤其是在炎热的夏季，由于气温较高，当封口打开后，该容器就由原来的无菌状态转为有菌状态，杂菌容易很快生长而污染试管苗。在去掉封口时采用培养基上加薄层水的处理效果较好，即可提高湿度又可减少杂菌生长，但若放置时间较长则需换水。待试管苗逐步适应外界的光照、温度和湿度后再进行移栽，即可提高移栽成活率。

(二)移栽技术

移栽时，首先将试管苗从所培养的瓶中取出，取时要用镊子小心地操作，切勿把根系损坏，然后把根部粘附的琼脂漂洗掉，要求全部除去，而且动作要轻，以减少伤根伤苗。琼脂中含有多种营养成份，若不去掉，一旦条件适宜，微生物就会很快滋生，从而影响植株的生长，甚至导致烂根死亡。移栽前，先将基质浇透水，并用一个筷子粗的竹签在基质中开一穴，然后再将植株种植下去，最好让根舒展开，