鱼腥藻7120中异形胞发育的影响因子

2005 年 4 月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2005

收稿日期：2004−05−18，修回日期：2004−06−29

作者简介：康瑞娟(1965−)，女，山东省茌平县人，在职博士，生化工程专业，Tel: (010)-82627074, E-mail: rjkang@.

鱼腥藻7120中异形胞发育的影响因子

康瑞娟1

, 施定基2

, 丛 威1

, 蔡昭铃1

, 欧阳藩1

(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080； 2. 中国科学院植物研究所光合作用研究中心，北京 100093)

摘 要：以鱼腥藻7120为对象，考察了碳源浓度和种类、氮源浓度和种类、光强及NaCl 浓度对鱼腥藻7120异形胞发育及发生频率的影响. 结果表明，NaNO 3和NH 4Cl 都会抑制异形胞的分化，NaNO 3对异形胞的抑制可以通过提高CO 2浓度而解除，但NH 4Cl 的抑制作用是彻底的；而添加NaHCO 3却不能在NO 3−存在时诱导鱼腥藻产生异形胞；提高光强和NaCl 浓度能够增加异形胞的比例. 证明了胞内碳氮比例的升高是异形胞分化的直接原因. 关键词：异形胞；鱼腥藻7120；碳氮比例

中图分类号：Q254 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2005)02−0209−04

1 前 言

鱼腥藻7120是一种丝状体固氮蓝藻，在氮源缺乏的情况下，大约每隔10个营养细胞形成1个异形胞[1]

. 异形胞可以直接固定大气中的N 2(分子态)，形成藻细胞可以利用的氮素化合物. 异形胞的形成与氮源和光源等外界因素密切相关. 实验证明，在蓝藻培养基中有机氮会增加异形胞的形成，结合态氮则会抑制异形胞的形成，而硝态氮的抑制作用较短暂，铵态氮的抑制作用较持久

[2,3]

. 但碳源与异形胞发育的关系则未见报道.

蓝藻通过异形胞固定的氮，除供给藻细胞本身的生长发育外，还会通过含氮化合物的分泌和藻细胞的分解，释放出大量的氨态氮，大大增加了水体和土壤的肥力，在农业生产中具有重要的应用价值[2]

. 近年来，随着世界性的能源短缺，可再生能源的研究和开发受到了广泛的关注. 利用异形胞中所含的氢酶生产H 2的研究是其中一项重要内容[4,5]

. 因此，有关异形胞形成的机制

不仅在细胞进化的研究中有重要的理论意义，更有广泛

的应用价值.

本工作以光生物反应器培养鱼腥藻7120，考察了不同培养条件下异形胞数量的变化与环境因子的关系.

2 材料与方法

2.1 实验材料

蓝藻：鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120来自中国科学院植物研究所.

试剂均为市售品，纯度为分析纯. 2.2 实验方法 2.2.1 培养基

培养基为含氮或无氮的BG11(BG110)培养基[6]

.

2.2.2 摇床培养

在含有17.6 mmol/L NaNO 3的BG11或以NaCl 取代NaNO 3的BG110培养基中接种鱼腥藻7120 (Anabaena sp. PCC 7120)，使接种后培养液的浓度(OD 750)为0.1左右，置于摇床上光照培养. 温度28∼30℃，光强为100 µmol/(m 2⋅s)，转速为130 r/min. 2.2.3 光反应器培养

反应器为自制的内环流式气升光生物反应器，总体积2.5 L ，工作体积2.0 L ，材质为耐热耐压的硅硼玻璃，可进行高温高压灭菌. 罐体下部的夹套中可通入恒温水以维持培养温度. 3个反应器为1组，放置在控制箱内，由安装在罐体前后的光源板提供光照，每块光源板横向平行排列6支日光灯管(18 W ，National ，北京)，光强为100 µmol/(m 2⋅s)，通气量为400 mL/min. 空气和CO 2浓度通过气体流量计控制，定量混合后，由孔径为0.2 µm 的空气过滤器(PALL 公司)除菌后通过进气管进入罐内. 将含2 L 培养液的气升式反应器在高压蒸汽灭菌锅中高温灭菌，冷却至室温，在超净台内将150 mL 种液倒入，放置在控制箱内，与气源和恒温水连接，开始培养. 2.3 异形胞频率

将不同培养条件下定时取出的样品置于光学显微镜下观察(XSZ −D 2型，重庆光学仪器厂)，分别计数营养细胞和异形胞的数目，并计算异形胞占细胞总数的百分比. 为了减小误差，每个样品统计1000个以上细胞，并重复3次取平均值. 2.4 NO 3−吸收速率

收集不同条件下培养的藻细胞，以BG110培养基洗3次并重悬浮. 分别加入终浓度为0, 50, 100, 150, 200,

250, 300 mmol/L 的NaNO 3，

并加入不同浓度的NaHCO 3或CO 2，在光强为100 µmol/(m 2⋅s)、温度28℃条件下放

置15 min 后，离心除去菌体，在220 nm 波长测定样品的吸光值，通过标准曲线计算出样品中所含的NO 3−浓度[7]. 样品的NO 3−吸收速率以含有1 µg 叶绿素的藻细胞每分钟吸收的NO 3－的摩尔数来表示. 每个样品至少测定3次.

2.5 叶绿素浓度的测定[8]

离心收集藻细胞，加入3 mL 甲醇，混匀后4℃浸泡6∼14 h ，4000 r/min 离心10 min ，取上清，测定A 665值. 根据公式Chl (µg/mL)=13.9A 665计算样品中叶绿素a 的含量.

3 结果与讨论

3.1 碳源的影响

将鱼腥藻7120接种于装有BG11或BG110培养基的气升式光生物反应器中，分别通入400 mL/min 空气或等量的含有1%, 3%, 5% CO 2的空气，或在培养基中添加10 mmol/L NaHCO 3，28℃光照培养，每天定时取样，于显微镜下观察细胞形态的变化.

实验中发现，在空气中培养时，在BG11培养基中生长的鱼腥藻仅能偶尔观察到异形胞，而在BG110中却有较大比例的异形胞，验证了NaNO 3抑制异形胞分化的观点. 在氮源缺乏的条件下，通入过多的CO 2对细胞生长产生较严重的抑制，说明蓝藻细胞维持碳氮代谢间平衡时，有利于藻细胞的生长，单独提高碳源或氮源浓度都会影响藻细胞的生长. 因此，只测定了1% CO 2条件下BG110中异形胞的数目.

在为期8 d 的培养过程中，异形胞的数量随生长周期变化，在实验的第2天异形胞出现，并持续到第8天实验结束. 异形胞的数量在对数生长期维持稳定(3∼5 d).不同条件下鱼腥藻7120在第3天时异形胞发生的频率列于表1中.

表1 不同培养条件下鱼腥藻7120异形胞发生的频率 Table 1 Heterocyst frequency (±SD) of Anabaena sp. PCC 7120

exposed to different inorganic carbon source conc. (%)

Conditions BG11 BG110 Air Occasionally observed 6.24±0.43 1% CO 2 3.34±0.37 7.82±0.30

3% CO 2 4.86±0.90 No data 5% CO 2 5.03±0.61 No data NaHCO 3 Occasionally observed 5.52±0.28

由表可见，在BG110培养基中通入1% CO 2时，异形胞数量比仅通空气时增加，而添加10 mmol/L NaHCO 3时异形胞数量比空气中略有减少；而在BG11中培养的鱼腥藻，通入1% CO 2后，产生了约占细胞总数3%的异形胞，且数量随CO 2浓度的增加而提高到5%. 而添加10 mmol/L NaHCO 3的样品与通空气培养的样品一样，也只能偶尔看到异形胞. 然而，在所有实验条件下，BG110中的异形胞比例都高于BG11.

实验结果表明，提高CO 2浓度可减弱NaNO 3对异形胞分化的抑制作用，但不能完全消除. 但添加NaHCO 3却不能在NaNO 3存在时诱导鱼腥藻产生异形胞.

为了考察两种无机碳对于异形胞发育的不同影响，测定了不同碳源对含氮和无氮培养基中生长的藻细胞的NO 3−吸收速率，结果见图1.

图1 不同碳源下含氮和无氮培养基中生长的藻细胞的NO 3−吸收速率 Fig.1 Nitrate uptake rate of Anabaena sp. PCC 7120 cultivated in a photobioreactor

in BG11 and BG110 media with different carbon sources

由图1可以看出，无论在含氮或无氮培养基中生长的鱼腥藻7120，无机碳的加入都降低了其NO 3−吸收速率，说明无机碳抑制NO 3−的吸收，其中CO 2的作用比

NaHCO 3更显著，对于无氮培养基中生长的细胞尤其如此. 由此可以揭示无氮培养的细胞异形胞发生频率较高的原因. Fogg [9]发现柱孢鱼腥藻的丝体被转移到不含氮

50

100

150200250300

N i t r a t e u p t a k e r a t e [m m o l /(L ·µg ·m i n )]

NaNO 3 concentration (mmol/L)

50100150200250300

12345NaNO 3 concentration (mmol/L)

N i t r a t e u p t a k e r a t e (m m o l /(L ·µg ·m i n )