鱼腥藻7120中异形胞发育的影响因子

2005 年 4 月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2005收稿日期：2004−05−18，修回日期：2004−06−29作者简介：康瑞娟(1965−)，女，山东省茌平县人，在职博士，生化工程专业，Tel: (010)-82627074, E-mail: rjkang@.鱼腥藻7120中异形胞发育的影响因子康瑞娟1, 施定基2, 丛 威1, 蔡昭铃1, 欧阳藩1(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080； 2. 中国科学院植物研究所光合作用研究中心，北京 100093)摘 要：以鱼腥藻7120为对象，考察了碳源浓度和种类、氮源浓度和种类、光强及NaCl 浓度对鱼腥藻7120异形胞发育及发生频率的影响. 结果表明，NaNO 3和NH 4Cl 都会抑制异形胞的分化，NaNO 3对异形胞的抑制可以通过提高CO 2浓度而解除，但NH 4Cl 的抑制作用是彻底的；而添加NaHCO 3却不能在NO 3−存在时诱导鱼腥藻产生异形胞；提高光强和NaCl 浓度能够增加异形胞的比例. 证明了胞内碳氮比例的升高是异形胞分化的直接原因. 关键词：异形胞；鱼腥藻7120；碳氮比例中图分类号：Q254 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2005)02−0209−041 前 言鱼腥藻7120是一种丝状体固氮蓝藻，在氮源缺乏的情况下，大约每隔10个营养细胞形成1个异形胞[1]. 异形胞可以直接固定大气中的N 2(分子态)，形成藻细胞可以利用的氮素化合物. 异形胞的形成与氮源和光源等外界因素密切相关. 实验证明，在蓝藻培养基中有机氮会增加异形胞的形成，结合态氮则会抑制异形胞的形成，而硝态氮的抑制作用较短暂，铵态氮的抑制作用较持久[2,3]. 但碳源与异形胞发育的关系则未见报道.蓝藻通过异形胞固定的氮，除供给藻细胞本身的生长发育外，还会通过含氮化合物的分泌和藻细胞的分解，释放出大量的氨态氮，大大增加了水体和土壤的肥力，在农业生产中具有重要的应用价值[2]. 近年来，随着世界性的能源短缺，可再生能源的研究和开发受到了广泛的关注. 利用异形胞中所含的氢酶生产H 2的研究是其中一项重要内容[4,5]. 因此，有关异形胞形成的机制不仅在细胞进化的研究中有重要的理论意义，更有广泛的应用价值.本工作以光生物反应器培养鱼腥藻7120，考察了不同培养条件下异形胞数量的变化与环境因子的关系.2 材料与方法2.1 实验材料蓝藻：鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120来自中国科学院植物研究所.试剂均为市售品，纯度为分析纯. 2.2 实验方法 2.2.1 培养基培养基为含氮或无氮的BG11(BG110)培养基[6].2.2.2 摇床培养在含有17.6 mmol/L NaNO 3的BG11或以NaCl 取代NaNO 3的BG110培养基中接种鱼腥藻7120 (Anabaena sp. PCC 7120)，使接种后培养液的浓度(OD 750)为0.1左右，置于摇床上光照培养. 温度28∼30℃，光强为100 µmol/(m 2⋅s)，转速为130 r/min. 2.2.3 光反应器培养反应器为自制的内环流式气升光生物反应器，总体积2.5 L ，工作体积2.0 L ，材质为耐热耐压的硅硼玻璃，可进行高温高压灭菌. 罐体下部的夹套中可通入恒温水以维持培养温度. 3个反应器为1组，放置在控制箱内，由安装在罐体前后的光源板提供光照，每块光源板横向平行排列6支日光灯管(18 W ，National ，北京)，光强为100 µmol/(m 2⋅s)，通气量为400 mL/min. 空气和CO 2浓度通过气体流量计控制，定量混合后，由孔径为0.2 µm 的空气过滤器(PALL 公司)除菌后通过进气管进入罐内. 将含2 L 培养液的气升式反应器在高压蒸汽灭菌锅中高温灭菌，冷却至室温，在超净台内将150 mL 种液倒入，放置在控制箱内，与气源和恒温水连接，开始培养. 2.3 异形胞频率将不同培养条件下定时取出的样品置于光学显微镜下观察(XSZ −D 2型，重庆光学仪器厂)，分别计数营养细胞和异形胞的数目，并计算异形胞占细胞总数的百分比. 为了减小误差，每个样品统计1000个以上细胞，并重复3次取平均值. 2.4 NO 3−吸收速率收集不同条件下培养的藻细胞，以BG110培养基洗3次并重悬浮. 分别加入终浓度为0, 50, 100, 150, 200,250, 300 mmol/L 的NaNO 3，并加入不同浓度的NaHCO 3或CO 2，在光强为100 µmol/(m 2⋅s)、温度28℃条件下放置15 min 后，离心除去菌体，在220 nm 波长测定样品的吸光值，通过标准曲线计算出样品中所含的NO 3−浓度[7]. 样品的NO 3−吸收速率以含有1 µg 叶绿素的藻细胞每分钟吸收的NO 3－的摩尔数来表示. 每个样品至少测定3次.2.5 叶绿素浓度的测定[8]离心收集藻细胞，加入3 mL 甲醇，混匀后4℃浸泡6∼14 h ，4000 r/min 离心10 min ，取上清，测定A 665值. 根据公式Chl (µg/mL)=13.9A 665计算样品中叶绿素a 的含量.3 结果与讨论3.1 碳源的影响将鱼腥藻7120接种于装有BG11或BG110培养基的气升式光生物反应器中，分别通入400 mL/min 空气或等量的含有1%, 3%, 5% CO 2的空气，或在培养基中添加10 mmol/L NaHCO 3，28℃光照培养，每天定时取样，于显微镜下观察细胞形态的变化.实验中发现，在空气中培养时，在BG11培养基中生长的鱼腥藻仅能偶尔观察到异形胞，而在BG110中却有较大比例的异形胞，验证了NaNO 3抑制异形胞分化的观点. 在氮源缺乏的条件下，通入过多的CO 2对细胞生长产生较严重的抑制，说明蓝藻细胞维持碳氮代谢间平衡时，有利于藻细胞的生长，单独提高碳源或氮源浓度都会影响藻细胞的生长. 因此，只测定了1% CO 2条件下BG110中异形胞的数目.在为期8 d 的培养过程中，异形胞的数量随生长周期变化，在实验的第2天异形胞出现，并持续到第8天实验结束. 异形胞的数量在对数生长期维持稳定(3∼5 d).不同条件下鱼腥藻7120在第3天时异形胞发生的频率列于表1中.表1 不同培养条件下鱼腥藻7120异形胞发生的频率 Table 1 Heterocyst frequency (±SD) of Anabaena sp. PCC 7120exposed to different inorganic carbon source conc. (%)Conditions BG11 BG110 Air Occasionally observed 6.24±0.43 1% CO 2 3.34±0.37 7.82±0.303% CO 2 4.86±0.90 No data 5% CO 2 5.03±0.61 No data NaHCO 3 Occasionally observed 5.52±0.28由表可见，在BG110培养基中通入1% CO 2时，异形胞数量比仅通空气时增加，而添加10 mmol/L NaHCO 3时异形胞数量比空气中略有减少；而在BG11中培养的鱼腥藻，通入1% CO 2后，产生了约占细胞总数3%的异形胞，且数量随CO 2浓度的增加而提高到5%. 而添加10 mmol/L NaHCO 3的样品与通空气培养的样品一样，也只能偶尔看到异形胞. 然而，在所有实验条件下，BG110中的异形胞比例都高于BG11.实验结果表明，提高CO 2浓度可减弱NaNO 3对异形胞分化的抑制作用，但不能完全消除. 但添加NaHCO 3却不能在NaNO 3存在时诱导鱼腥藻产生异形胞.为了考察两种无机碳对于异形胞发育的不同影响，测定了不同碳源对含氮和无氮培养基中生长的藻细胞的NO 3−吸收速率，结果见图1.图1 不同碳源下含氮和无氮培养基中生长的藻细胞的NO 3−吸收速率 Fig.1 Nitrate uptake rate of Anabaena sp. PCC 7120 cultivated in a photobioreactorin BG11 and BG110 media with different carbon sources由图1可以看出，无论在含氮或无氮培养基中生长的鱼腥藻7120，无机碳的加入都降低了其NO 3−吸收速率，说明无机碳抑制NO 3−的吸收，其中CO 2的作用比NaHCO 3更显著，对于无氮培养基中生长的细胞尤其如此. 由此可以揭示无氮培养的细胞异形胞发生频率较高的原因. Fogg [9]发现柱孢鱼腥藻的丝体被转移到不含氮50100150200250300N i t r a t e u p t a k e r a t e [m m o l /(L ·µg ·m i n )]NaNO 3 concentration (mmol/L)5010015020025030012345NaNO 3 concentration (mmol/L)N i t r a t e u p t a k e r a t e (m m o l /(L ·µg ·m i n )第2期 康瑞娟等：鱼腥藻7120中异形胞发育的影响因子 211的培养基中，在光照下其细胞的C:N从4.5:1增到6:1时异形胞开始分化. 在固氮的条件下，细胞的C:N比达到8:1时异形胞即大量发生. 本结果进一步说明，胞外环境中碳氮比的改变对异形胞的发育不产生直接的影响，起作用的可能主要是细胞内的C/N比例.藻细胞对CO2和HCO3−的吸收经由各自独立的转运系统[10,11]. CO2通过被动扩散进入藻细胞[12]，与仅需要4个电子的CO2同化过程相比，NO3−的吸收还原需要消耗1个电子[13]，因此在与CO2竞争电子和能量方面处于劣势，由此引起藻细胞内碳氮比的上升，使氮的供给相对处于限制状态，从而诱导了异形胞的分化. 而HCO3−和NO3−的吸收都由耗能的主动运输途径完成[14]. 因此HCO3−引起的胞内碳氮比的上升比CO2要小得多.3.2 氮源浓度的影响为验证胞外环境中碳氮比的改变对异形胞的发育不产生直接影响的推论，将培养基中氮源的浓度分别增加1和2倍，通入含有3% CO2的空气培养鱼腥藻7120，考察氮源浓度对异形胞发育的影响，结果见表2.表2 氮源浓度对鱼腥藻7120异形胞发育的影响Table 2 Effect of NaNO3 concentration on heterocystfrequency of Anabaena sp. PCC 7120NaNO3 conc. (mmol/L) Heterocyst frequency (%)17.6 5.36±0.2335.2 4.42±0.3052.8 4.42±0.08由表2可见，氮源加倍后仍有相当数量的异形胞产生，频率仅略有下降. 实验结果表明，高CO2浓度下，培养基中过量的氮源不能抑制异形胞的产生，进一步证明了胞外环境中碳氮比的改变对异形胞的发育不产生直接影响，胞内氮源相对缺乏是异形胞分化的根本原因.3.3 氮源种类的影响以4 mmol//L NH4Cl和尿素取代BG11中的NaNO3，分别在添加NaHCO3和3% CO2及只通空气条件下培养鱼腥藻7120，考察不同无机碳浓度下氮源种类对异形胞发育的影响. 实验表明，在以NH4Cl和尿素为氮源的培养基中，所有实验中均无异形胞产生，而且鱼腥藻细胞在含有尿素的培养基中不能很好地生长，2∼3 d后死亡. 表明了氨态氮对异形胞的抑制是彻底的[2]，同时表明尿素不宜用作鱼腥藻培养的氮源.3.4 光强的影响在含有BG11培养基的光生物反应器中通入3% CO2，其中一个反应器的侧壁以双层塑料薄膜包裹起来，使光强为正常条件下的一半，考察光强对鱼腥藻异形胞发育的影响，结果列于表3中.表3 光强对鱼腥藻异形胞发育的影响 Table 3 Effect of light intensity on heterocyst frequency of Anabaena sp. PCC 7120 (%)Cultivation time (d)High light illumination Low light illumination2 5.36±0.23 4.44±0.163 4.42±0.30 3.25±0.324 4.42±0.08 2.70±0.26由实验发现，不同光强下生长的藻细胞都在培养1 d后产生异形胞，但在较高光强下的藻细胞中异形胞所占的比例较高，并持续出现，直到约1周后进入稳定期才消失；而在低光强下培养的藻细胞中异形胞较少，且逐天减少，约4 d后消失. 这可能是由于在低光强下藻细胞的光合活性降低，对碳氮的需求都减少所造成的.3.5 盐浓度的影响为考察盐浓度对鱼腥藻碳氮代谢的影响，在BG11中加入50 mmol/L NaCl，分别在通入空气、含1% CO2空气及加入10 mmol/L NaHCO3条件下，在反应器中培养鱼腥藻细胞，取对数生长期的样品，对其中的异形胞比例计数，并与BG11中(不含NaCl)的培养结果比较，结果见表4. 由表可见，当加入50 mmol/L NaCl后，3种培养条件下异形胞占细胞总数的比例都有显著增加，而且在仅通入空气的样品中产生了大量的异形胞. Rai 等[15]曾报道当NaCl浓度小于150 mmol/L时，异形胞的比例会随盐浓度的增加而增加，原因在于NaCl会抑制固氮酶的活性，藻细胞可能以增加异形胞数量的方式弥补由于固氮酶活性下降造成的氮供给不足.表4 盐浓度对鱼腥藻7120异形胞发生频率的影响 Table 4 Effect of NaCl concentration on heterocyst frequency of Anabaena sp. PCC 7120 (%)BG11BG11+50 mmol/L NaCl Air Occasionallyobserved5.26±0.391% CO2 3.34±0.37 6.55±0.1710 mmol/L NaHCO3 Occasionally observed 2.51±0.144 结 论通过改变碳源浓度和种类、氮源浓度和种类、光强及NaCl浓度，考察了一系列环境因子变化对鱼腥藻7120异形胞发育及发生频率的影响，结果表明，增加CO2和NaCl浓度、提高光强均能促进异形胞的分化. CO2和NaHCO3均抑制藻细胞对NO3−的吸收，但CO2的抑制作用更强. 因此，CO2浓度提高可以诱导鱼腥藻细胞在NaNO3存在的条件下大量产生异形胞，而增加NaHCO3则没有这种效果.参考文献：[1] Ramaswamy K S, Endley S, Horvitz H R, et al. Nitrate ReductaseActivity and Heterocyst Suppression on Nitrate in Anabaena sp. Strain PCC 7120Require moeA [J]. J. Bacteriol., 1996, 178: 3893−3898.212 过程工程学报第5卷[2] 周云龙. 异形胞与蓝藻固氮 [J]. 生物学通报, 1994, 29: 5−6.[3] Wolk C P, Ernst A, Elhai J. Heterocyst Metabolism and Development[A]. Bryant D A. The Molecular Biology of Cyanobacteria [C].Dordrecht: Kluwer Academic, 1994. 769−823.[4] Kumazawa S. Photoproduction of Hydrogen by the MarineHeterocystous Cyanobacterium Anabaena Species TU37-1 under a Nitrogen Atmosphere [J]. Mar. Biotechnol., 2003, 5: 222−226.[5] Berman-Frank I, Lundgren P, Falkowski P. Nitrogen Fixation andPhotosynthetic Oxygen Evolution in Cyanobacteria [J]. Res.Microbiol., 2003, 154: 157−164.[6] Castenholz R W. Culturing Methods for Cyanobacteria [A]. Packer L,Glazer A N. Methods in Enzymology [C]. 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Research Center of Photosynthesis, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China) Abstract:Anabaena sp. strain PCC7120 was a filamentous cyanobacterium that was capable of both oxygenic photosynthesis and aerobic nitrogen fixation. Heterocysts were developed from vegetative cells, which provided a suitable anaerobic environment for nitrogenase. The regulation of heterocyst development was influenced by several factors including concentrations, species of carbon and nitrogen sources, light intensity and NaCl concentration. In this paper, the effects of these factors on heterocyst differentiation in Anabaena sp. PCC7120 were studied. Results showed that NaNO3 and NH4Cl inhibited the development of heterocyst. But the elevated CO2 eliminated the inhibition of NaNO3 but not that of NH4Cl. The addition of NaHCO3 into the medium did not induce the production of heterocyst. Heterocyst frequency was enhanced by higher light intensity and NaCl concentration. It was found that heterocyst differentiation was induced in the presence of NaNO3 by elevated CO2, which was different from the opinion that Anabaena sp. strain PCC 7120 contained only vegetative cells in the presence of NaNO3.Key words:Anabaena sp. PCC7120; carbon and nitrogen ratio; heterocyst。