谷氨酸对神经元钙离子内流和凋亡的_省略_及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究_李小刚

·基础研究·
谷氨酸对神经元钙离子内流和凋亡的影响
及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究
李小刚1
,朱　克2
,李　楠2
,马向晨2
,李建国
2
(1.北京大学第三医院神经内科,北京100083;2.中国人民解放军总医院神经内科,北京100853)
摘要:目的　探讨兴奋性氨基酸谷氨酸介导神经元钙离子内流与诱导神经元凋亡间的关系。

方法　体外培养新生大鼠皮质神经元,用原位末端标记技术显示凋亡细胞;用激光共聚焦方法来观察细胞内钙离子浓度变化;谷氨酸处理神经元造成兴奋性氨基酸毒性;用MK -801做保护研究。

结果　体外培养9d 的大多数神经细胞,用1mmol /L 谷氨酸处理后,细胞内钙离子快速增加;谷氨酸处理后细胞死亡的形式主要是凋亡。

预先用MK -801(10μmol /L )可明显的减少由谷氨酸介导的钙离子反应,并且MK -801可同时减少谷氨酸诱导的细胞凋亡。

结论　谷氨酸诱导的神经元钙离子内流与细胞凋亡有明显的关系,钙离子内流在与谷氨酸毒性导致的细胞凋亡中起重要作用。

关键词:谷氨酸;细胞培养;凋亡
中图分类号:Q517 文献标识码:A 文章编号:1009-0126(2001)02-0122-04
Stu dy on glutamate -induced Ca 2+influx and apoptosis -like death in cu ltured
neurons and protective effect of glutamate receptor antagonist
LI Xiao -gang ,ZHU Ke ,LI Nan ,et al
(Depa rtment of Neur ology ,Third H osp ital ,Beijing University ,Beijing 100083,China )
A bstract :Objective To clarify the relationship between neuronal Ca 2+influx and apoptosis -like death in -duced by a toxic glutamate challenge .Methods Cer ebral cortical neuronal culture ,TUNEL technique in situ for examination of apoptotic cells ,fluo -3and confocal laser micr oscopy for measurement of intracellular calcium levels ,gluta mate -induced neurotoxicity and MK -801protection were used in this study .Results In most cells
cultured in vitro for 9days ,the Ca 2+increased rapidly after exposure to 1mmol /L glutamate .Glutamate in -duced death in cultured neurons was mainly apoptosis -like death .Pretr eatment of the cultured neurons with MK -801(10μmol /L )caused a marked reduction in the calcium signals generated by subsequent glutamate stimulation ,and ,further more ,MK -801could also reduce gluta mate -induced apoptosis -like death .Conclusions There is striking correlation between neur onal Ca 2+influx and apoptosis -like death induced by a toxic gluta -mate challenge .These data suggest that Ca 2+influx plays a major role in apoptosis -like death associated with glutamate toxicity .Key words :glutamic acid ;cell culture ;apoptosis 收稿日期:2000-11-09
作者简介:李小刚,男,1964年11月生,江西省南丰县人,主治医师,
博士,从事神经病学专业。

谷氨酸是脑组织内主要的兴奋性氨基酸,在某些情况下,对神经元也有毒性作用[1]。

有学者认为,兴奋性毒性是脑卒中、低血糖、癫痫、Huntington 病和Alzheimer 病[2]的发病机制。

谷氨酸及其化合物所致的神经元损害可能是由于过度刺激受体的结果,而钙离子在这个过程中起关键作用,细胞内钙离子超载介导N -甲基-D -门冬氨酸(NMDA )受体过度刺激
引起细胞死亡。

虽然已提出钙离子和钠离子内流增
加、自由基的产生、代谢酶的破坏、细胞膜衰竭及细胞骨架的破坏等学说[1],但兴奋性氨基酸引起的神经细胞死亡的机制仍不清楚。

早期研究认为,兴奋性毒性导致的细胞死亡的形式是坏死[1]。

然而,近来研究结果证明,有些细胞死亡实际上是凋亡[3,4]。

细胞死亡的模式决定于损伤的程度[5]。

这种不一致性可能是由于同时存在坏死和凋亡[4,5]。

我们用新生大鼠原代培养的皮质神经元、激光共聚焦显微镜、Fluo -3荧光染色、TUNE L 法等技术重点研究谷氨酸处理后,单个神经元早期细胞内钙离
子变化和形态改变及谷氨酸受体拮抗剂MK-801的保护作用。

1　材料和方法
1.1　材料　程序性细胞死亡检测试剂盒(德国Boehringer公司):试剂盒包括TdT酶、含生物素化duTP缓冲液,含NBT和BCIP底物的显色液、含链亲合素化的碱性磷酸酶(HRP-streptavidin)的反应液等; Fluo-3-AM、Triton X-100、L-谷氨酸、MK-801(美国Sig-ma公司);HE PE S(德国B oehringer公司);D ME M培养液(美国Gibco-BRL公司)。

1.2　细胞培养　取出生1～2d的Wistar大鼠(二级),在无菌条件下断头、取脑,分离出双侧皮质,置于0.125%胰蛋白酶消化液中,在37℃、5%CO2条件下孵育30min,用细口径滴管吹打数次,以种植培养液稀释成5×106个细胞/ml密度,接种于涂有多聚赖氨酸(50mg/L)的96孔板和含盖玻片的(18mm×18mm)玻璃培养皿(直径35m m,2ml/每皿)中,置标本于37℃、5%CO2培养箱中。

细胞培养液含80% DMEM培养液、10%马血清、10%胎牛血清、葡萄糖6g/L、苄基青霉素100kU/L和链霉素100mg/L。

接种第3天,在血清培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制非神经细胞的过度增殖。

48h后更换新鲜饲养液。

以后每周换液2次,每次更换一半新鲜饲养培养液。

用NSE单克隆抗体免疫组化染色证明细胞是神经元。

培养第9天开始做谷氨酸实验。

1.3　凋亡细胞的检测　原位凋亡细胞的检测用TUNEL技术稍做改动[6]。

在盖玻片上培养的神经细胞用4%多聚甲醛在4℃固定2h,用10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)冲洗,加入20mg/L蛋白酶K,室温30min,PBS洗5min,加入0.3%H2O2(甲醇溶解),PBS洗2次,加0.1%Triton X-100(0.1%醋酸钠配制),冰浴2min,PBS洗2次,凉干,加TUNEL反应液(1μl TdT+9μl含Biotin-dUTP缓冲液),置湿盒中,37℃,60min(阴性对照组不加酶);加入显色液,置于暗盒中60min,0.5%甲基绿复染20s,二甲苯透明,明胶封片,显微镜下观察有蓝紫色颗粒者为阳性。

在显微镜下记数凋亡细胞。

1.4　Fluo-3测定细胞内钙离子的含量　激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)培养的细胞用含AM 的Fluo-3(10μmol/L)在室温(26℃)染色2h。

用含钙、镁的PBS洗3次后,将96孔培养板放入激光共聚焦显微镜扫描平台。

在40倍长工作距离的物镜下动态观察Fluo-3指示钙离子的变化。

在时间序列程序下,开始预扫描。

在对照的图像确定后,立即用微量加样器将少量1mmol/L谷氨酸加入培养孔中,神经元的荧光图像每4s记录1次,共250s,并绘制出细胞内Fluo-3的荧光强度在加药后随时间变化的曲线。

在保护实验中,MK-801(10μmol/L)在用谷氨酸之前5min加入。

2　结　果
2.1　培养神经元用谷氨酸处理后凋亡细胞的结果　在对照组中,可观察到少数染色阳性的细胞,与用相似方法培养的神经元中持续少量细胞死亡一致。

培养神经元在1mmol/L谷氨酸处理后24h,染色阳性的细胞与非凋亡细胞相比,在显微镜下可见浓缩和核裂解,(56±3)%(计15个视野)表现为染色阳性的细胞。

预先用10μmol/L MK-801后,染色阳性的细胞为(11±1)%(共进行4批实验,P<0.05)。

2.2　谷氨酸导致细胞内钙离子快速增加　用Fluo-3染色后用激光共聚焦显微镜观察钙离子浓度。

当加入1mmol/L谷氨酸时,80%以上的细胞(观察30个视野)显示Fluo-3的荧光强度增加,经校正后绘制荧光强度的时间曲线向上,说明钙离子增加。

尽管谷氨酸持续存在,但信号强度在数分钟内减弱。

在这个反应中,MK-801完全阻断Fluo-3这种荧光强度的增加。

3　讨　论
在本研究中,我们用原位末端标记法,在谷氨酸处理后24h可见大多数聚集在一起的死亡细胞表现为凋亡样形态,由于MK-801能明显地减少这些染色阳性的凋亡细胞,因此,这种由谷氨酸诱导的细胞凋亡很可能是通过谷氨酸受体介导的。

应用共聚焦显微镜,我们检测到谷氨酸诱导神经元内的钙浓度快速增加,细胞质和细胞核内的钙离子都增加。

这种反应可被MK-801抑制,表明钙离子的增加依赖细胞外离子的存在,说明由谷氨酸诱导的钙离子增加可激活核酸内切酶,导致神经元内DNA断裂。

本研究结果显示,谷氨酸对神经元有兴奋性毒性,与以往的研究结果一致[7],虽然兴奋性毒性的浓度、处理的时间及神经元的成熟等会影响神经元变性的最大程度。

然而,NMDA受体在兴奋性毒性细胞死亡过程中可能起重要作用,因为这种受体拮抗剂如AP-5和MK-801等能预防谷氨酸毒性[7]。

在我们的实验中,MK-801还抑制谷氨酸介导的细胞内游离钙离子信号。

凋亡,也称程序性细胞死亡,具有特征性形态学改变,凋亡的特征是染色质致密和核皱缩;坏死是快速的细胞和细胞器肿胀。

有证据表明,有些兴奋性毒性是凋亡过程[4,8],这与以前认为兴奋性毒性死亡只通过坏死的机制的观点[1]不符。

有研究结果表明,在皮质、纹状体及海马神经元的兴奋性毒性可能导致坏死和凋亡[8]。

在皮质神经元培养中,细胞死亡的形式由刺激的程度决定(轻度是凋亡,重度是坏死)[5]。

我们的研究结果显示,用原位TUNEL法显示,体外培养的大鼠皮质神经元用谷氨酸刺激后24 h,细胞死亡主要表现为凋亡的形态特征,与以往描述的迟发性凋亡相似[7],MK-801能预防谷氨酸的这种损害。

我们通过测定培养神经元中谷氨酸刺激后细胞内钙离子水平来了解这种保护作用的机制。

兴奋性氨基酸介导细胞内钙离子水平超过某个域值后,在神经细胞死亡中起重要作用[9]。

但是钙离子进入细胞内的机制对神经元的毒性起重要作用,通过谷氨酸受体进入细胞导致死亡[10],而K+[11]或氰化物[12]也可使钙离子浓度增加,却对神经元无毒性。

谷氨酸所致钙离子内流的机制很复杂,包括通过NMDA受体离子通道[13]和细胞内钙离子重分配[14]。

通过NMDA受体通道[15]、细胞内钙离子释放[14]或细胞内钙螯合物[16]等阻止钙进入细胞内,可防止兴奋性氨基酸介导的细胞死亡。

虽然NMDA 受体激活不是通过电压-门依赖钙通道引起钙内流[17],但有些证据表明,阻止电压-门依赖钙通道也能预防神经细胞死亡[18],同时,在海马神经元[19]和小脑颗粒细胞[20]也有类似的现象。

研究结果表明,钙离子通道阻滞剂尼群地平不能减少谷氨酸介导的钙离子升高。

导致神经元死亡的钙离子升高的机制和来源还不完全清楚,因此,不能明确谷氨酸刺激钙信号的单个成分,这样只能预防存在于NMDA受体和(或)与钙离子库释放或钙平衡有关的细胞内部分等敏感部分,他们都能减少细胞内钙负荷。

Wood等[21]报道,神经保护和NMDA 受体失敏感之间有直接关系,即可防止谷氨酸的毒性也可抑制NMDA介导的谷氨酸刺激钙增加的失敏感性。

NMDA受体失敏感性能预防慢性凋亡,与我们的研究结果相似。

许多急性和慢性神经疾病可能通过谷氨酸受体的过度刺激介导。

我们的证据表明,谷氨酸介导的钙离子内流是通过激活NMDA受体实现的,MK-801能减少这种内流,另外,MK-801能预防谷氨酸所致的细胞凋亡。

参　考　文　献
1　Choi DW.Excitotoxic cell death[J].J Neurobiol,1992,23:1261-1276. 2　Lipton SA,R os enberg PA.Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic dis orders[J].N Engl J Med,1994,330:613-622.
3　Kure S,Tominaga T,Yoshimoto T,et al.Glutamate triggers internucleo-s omal DNA cleavage in neuronal cells[J].Biochem Biophy Res Com-mun,1991,179:39-45.
4　Staton PC,Bris tow DR.The dietary excitot oxinsβ-N-methylamino-L-ala-nine andβ-N-oxal ylamino-L-alanine induce necrotic-and apoptotic-l ike death of rat cerebellar granule cells[J].J Neurochem,1997,69:1508-1518.
5　Bonfoco E,Krainc D,Ankarcrona M,et al.Apoptosis and necrosis:t wo distinct events induced res pectivel y,by mild and intense ins ults with N-methyl-D-as partate or nitric oxide/s uperoxide in cortical cell cultures [J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7162-7166.
6　Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sass on SA.Identification of programmed cell death in situ via s pecific labeling of nucl ear D NA fragmentation[J].J Cell Biol,1992,119:493-501.
7　Ankarcrona M,Dypbukt J M,Bonfoco E,et al.Glutamate-induced neu-ronal death:a s uccession of necrosis or apoptosis depending on mitochon-drial function[J].Neuron,1995,15:961-973.
8　van Lookeren-Campagne M,Lucass en PJ,Vermeulen JP,et al.N MDA and kainate induce internucleosomal DNA cleavage as sociated with both apoptotic and necrotic cell death in the neonatal rat brain[J].Eur J Neu-ros ci,1995,7:1627-1640.
9　Choi DW.Glutamate-mediated neurotoxicity:rel ations hip to specific channel types and role in ischaemic damage[J].Trends Neurosci,
1988,11:465-469.
10　Damschroder-Williams P,Irwin R P,Lin SZ,et al.Characteriz ation of the excitoprotective actions of N-methyl-D-aspartate in cult ured cerebel-lar granul e neurons[J].J Neurochem,1995,65:1069-1076.
11　Tymianski M,Wang LY,MacD onald J F.Alteration of neuronal calci um homeostasis and excitotoxic vul nerabil it y by c hronic depolarization[J].
Brain R es,1994,648:291-295.
12　Dubinsky J M,Rothman SM.Intracell ular calcium concentrations during “chemical hypoxia”and excitotoxic neuronal injury[J].J Neurosci, 1991,11:2545-2551.
13　Mayer ML,M iller RJ.Excitatory amino acid receptors,second mes sengers and regulation of intracellular Ca2+in mammal ian neurons[J].Trends Pharmacol Sci,1990,11:254-260.
14　Mody I,M acDonald J F.NMDA receptor-dependent excitotoxicity:the role of intracellular Ca2+release[J].Trends Pharmacol Sci,1995,16:356-359.
15　Schramm M,Eimerl S,Cos ta E.Serum and depolarizing agents cause a-cute neurotoxicity in cultured cerebellar granul e cell s:role of the gl uta-mate receptor res pons ive to N-methyl-D-aspartate[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:1193-1197.
16　Tymianski M,Wallace MC,Spigel man I,et al.Cell-permeant Ca2+ chelators reduce earl y excitotoxic and isc hemic neuronal injury in vitro and in vivo[J].Neuron,1993,11:221-235.
17　Savidge JR,Bristow DR.Routes of N M D A-and K+-sti mulated calci um
entry in rat cerebellar granule cells [J ].Neurosci Lett ,1997,229:1-4.18　Weiss J H ,Hartley DM ,Koh J ,et al .The calcium channel bloc ker
nifedipine attenuates slow excitatory amino acid neurotoxicity [J ].Sci -ence ,1990,247:1474-1477.
19　Randall RD ,Thayer SA .Glutamate -induced calcium transient triggers
delayed calcium overload and neurotoxicity in rat hippocampal neurons [J ].J Neuros ci ,1992,12:1882-1895.
20　DeErausquin GA ,M anev H ,Guidotti A ,et al .Gangliosides normalize
dis torted s ingle -cell intracell ular free Ca 2+dynamics after toxic dos es of glutamate in cerebellar granule cells [J ].Proc Natl Acad Sci U SA ,1990,87:8017-8021.
21　Wood AM ,Bristow DR .N -methyl -D -aspartate recept or desens itiz ation is
neuroprotective by inhibiting gluta mate -induced apoptotic -l ike death [J ].J Neuroche m ,1998,72:677-687.
·论著摘要·
冠心病合并糖尿病患者冠状动脉病变的特征
唐礼江,沈卫峰,张建盛,张大东,胡　健,胡　伟,张　宪,郑爱芳
(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科,上海200025)
关键词:冠心病;糖尿病;冠状动脉造影
中图分类号:R541.4 文献标识码:A 文章编号:1009-0126(2001)02-0125-01收稿日期:2000-06-08
作者简介:唐礼江,男,1964年5月生,浙江省台州市人,副主任医师,
硕士,从事冠心病和心瓣膜病介入诊治专业,现在浙江省台州医院心内科,浙江台州317000。

糖尿病是冠心病的一个经典危险因素。

近年来,糖尿病的发病率有所增高,同时其心血管并发症已成为糖尿病患者的主要死亡原因,约为非糖尿病患者的2～3倍。

本文回顾性分析连续402例冠状动脉(冠脉)造影证实冠脉病变患者,以探讨糖尿病合并冠心病患者的冠脉病变特征。

1　材料和方法
研究对象:包括1996年1月至1999年6月的402例经冠脉造影证实冠脉病变患者,其中大部分尚接受PTCA 和/或支架术治疗。

402例中,男性328例,女性74例,平均年龄59.1岁,其中合并糖尿病76例(糖尿病组),无糖尿病326例(非糖尿病组)。

详细记录各例临床资料,包括冠心病易患因素和急性冠脉事件(包括不稳定性心绞痛和急性心肌梗死)。

冠脉造影:用标准Judkins 法作冠脉造影,并由两位经验丰富的医师以目测法评估病变部位及狭窄程度(冠脉内径减小≥50%为有意义狭窄)。

将左前降支分为3段;第一角支前为近段,第一与第二角支之间为中段,第三角支以下为远段;左回旋支依据钝缘支分为近端与远段;右冠脉也分为3段:右室支发出前为近段,右室支与急缘支之间为中段,急缘支后为远段。

将病变位于左主干、左前降支近段和中段、右冠近段和中段、回旋支近段者定义为近端病变;将病变位于左前降支、回旋支和右冠脉远段、角支、钝缘支和后降支定义为远端病变。

病变长度≥2cm 、一支血管中≥2段病变及多处弥漫性狭窄者定义为弥漫性病变。

2　结　果
临床资料:两组的年龄、性别、高血脂、吸烟及稳定性心绞痛发生率差异无显著性意义,但糖尿病组中高血压和急性冠脉事件发生率显著高于非糖尿病组(P 均<0.001)。

冠脉造影发现:与非糖尿病组相比,糖尿病组多支血管病变增多,且病变弥漫(P <0.01),但两组冠脉病变部位相似。

糖尿病患者中度冠脉狭窄(内径减小50～70%)发生率较非糖尿病组有增加趋势(P =0.051)。

3　讨　论
糖尿病患者常合并脂质代谢和凝血及纤溶系统异常,同时伴有高血压者多,这些可加重和加速冠脉粥样硬化病变的程度与进程,使心性死亡和脑血管及周围血管病变并发症增多。

糖尿病已被认为是冠心病经典的独立危险因素。

许多冠脉造影及尸检研究表明,糖尿病冠心病患者存在弥漫且严重的冠脉病变,这些患者多支及弥漫性冠脉病变发生率增高。

本研究结果显示,糖尿病组二或三支血管病变及弥漫性病变者较非糖尿病组显著增多(P <0.01),但是两组的远段或近段冠脉病变发生率差异无显著性意义。

同时,本研究中糖尿病组合并高血压者增多,提示糖尿病可能存在广泛的周围血管(尤其是肾动脉)病变。

本研究显示,糖尿病患者的中度冠脉狭窄(内径减小50～70%)较非糖尿病组有增加趋势(P =0.051)。

以往的研究表明,这种富含脂质的中度冠脉狭窄,更易发生粥样斑块的破裂,导致冠脉内血栓形成和急性心肌梗死及不稳定性心绞痛。

这些与本研究糖尿病组急性冠脉事件增加相一致。

总之,本研究表明,糖尿病合并冠心病者通常存在弥漫及多支冠脉病变,其急性冠脉事件发生率增高。

因此,控制糖尿病对减少心血管并发症和改善冠心病患者预后具有重要意义。