间充质干细胞在造血干细胞移植中的作用

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多

间充质干细胞的免疫原性及其在移植中的应用

间充质干细胞的免疫原性及其在移植中的应用目的：探讨研究间充质干细胞的免疫原性以及rMSCs在临床移植中的应用。 方法：使用免疫组化方法鉴定rMSCs表面rat LA-ABC、rat LA-DR、CD80、CD86分子，并使用流式细胞术检测其含量；免疫组化法rMSC表面MHCI、Ⅱ类分子的鉴定。结果：rat LA-ABC分子在大鼠间充质干细胞的表面的表达率为13.08%，同时rat LA-DR以及CD80、CD86分子在大鼠间充质干细胞的表面均未有不表达，而外周血淋巴细胞PBLs的表面对rat LA-ABC、rat LA-DR、CD80、CD86这些分子的表达率分别为92.71%、22.39%、14.08%、9.03%。光学显微镜下观察细胞染色情况，细胞核中有棕黄染色者为阳性细胞。结论：MSC具有多向分化潜能，特性稳定；MSC不表达MHCⅡ类分子,不表达或极低表达MHCI类分子，能逃脱宿主免疫系统的排斥，异基因MSC可以进入宿主细胞，并能长期存在。MSC具有低免疫原性，临床上大大降低移植排斥及移植物抗宿主病，提高临床移植的存活率。 [Abstract] Objective: To investigate the mesenchymal stem cells of the immunogenicity and rMSCs in clinical transplantation. Methods: Immunohistochemistry identified rMSCs surface rat LA-ABC, rat LA-DR, CD80, CD86 molecules, and using flow cytometry and their contents; immunohistochemistry rMSC surface MHCI, Ⅱmolecule identification. Results: rat LA-ABC molecules in rat mesenchymal stem cell surface expression was 13.08%, while rat LA-DR and CD80, CD86 molecules in rat mesenchymal stem cells are not expressed on the surface were not suits the week the surface of blood lymphocytes PBLs of rat LA-ABC, rat LA-DR, CD80, CD86 expression of these molecules were 92.71%, 22.39%, 14.08%, 9.03%. Cells were observed under light microscope staining, nuclei were stained in brown positive cells. Conclusion: MSC have multilineage differentiation potential, characteristics and stability; MSC did not express MHC Ⅱmolecules, did not express or very low expression of MHCI molecules, can escape the host immune system rejection, allogeneic MSC can enter the host cell, and long-term existence. MSC with low immunogenicity, greatly reduce the clinical transplant rejection and graft versus host disease, improve the survival rate of clinical transplantation. [Key words] Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; Immunogenicity; Transplant; Clinical appication 间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是指源自未成熟的胚胎结缔组织的细胞。是可形成多种细胞类型的多能干细胞[1]。大鼠间充质干细胞（Rats MSCs）作为中胚层发育的早期细胞，其具备自我更新与多向分化的能力，经体外培养后可以进一步分化为骨细胞、软骨细胞等[2]。rMSCs除了在骨髓中主要存在之外，在大鼠机体的脂肪、血液、肺以及脐血中都有存在，因此随着近年来组织细胞学的发展，间充质干细胞在临床移植方面的应用也正不断扩大[3]。为探讨研究间充质干细胞的免疫原性以及rMSCs在临床移植中的应用，本文将所

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。

脐带间充质干细胞培养方法

(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化

造血干细胞移植的护理常规

造血干细胞移植的护理常规 1、移植前的护理 1.1、供者准备选用HLA相合的同细胞作为最适合供者，移植前两周对供者进行循环采血。 1.2、无菌层流室的准备：室内一切物品需经清洁、消毒、灭菌处理，室内不同空间采样，行空气细菌检测合格后病人方可进入。 1.3、病人准备： 1.3.1、心理护理：对病人及家属详细讲解骨髓移植的方法，过程和相关知识，使其有充分的思想准备和经济准备，鼓励病人建立战胜疾病的信心。 1.3.2、进行全面的身体检查。 1.3.3、无菌护理：进行口、眼、耳、肠道的无菌准备，行药浴，更换无菌衣裤后进入无菌室。 1.3.4移植前一天行中心静脉插管。 1.3.5预处理：是指全身射线照射和使用免疫抑制剂。其目的是杀灭受者的免疫活性细胞，使之失去排斥外来细胞的能力，从而允许供者的骨髓植入而使造血功能重建，同时还可消灭体内的异常细胞起到一定的治疗作用。执行预处理方案时需密切观察病情变化，鼓励病人多饮水，每天入水量4000ml以上，防止尿酸性肾病的发生。 2、术中护理 2.1、正确采集骨髓或外周造血干细胞，并保证足够的细胞数。 2.2、骨髓液回输：在无菌层流室6小时输完，每袋骨髓液至最后5ml时应留在袋中弃去，以防脂肪颗粒进入血液循环引起肺栓塞，外周血干细胞不需要过滤。 2.3、病情观察：监测生命体征的变化，并注意观察病人有无胸闷，气促等情况，配合医生做好相应处理。 3、移植后护理 3.1、心理护理：护士应多与病人交谈，调节病人情绪，传递家属信息，以解除病人的恐惧心理和孤独感，充分调节病人的积极性。 3.2、并发症护理： 3.2.1、感染；是最常见的并发症，对骨髓移植病人必须实行全环境保护：a严格执行无菌环境的清洁及消毒隔离制度b严格落实病人的各项无菌护理c 加强扩胸运动，防止肺部感染ｄ严密观察生命体征及病情变化。

17.1.9间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病

间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病 对一名安省的硬皮病（scleroderma）的患者来说，一个实验性的干细胞治疗方式为其健康状况带来180度的转变。安省圣托马斯（St. Thomas）的49岁居民慕斯卡特（Dan Muscat，图）于2014年患上系统性硬皮病，由于他皮肤胶原增生，导致他全身皮肤变硬变紧。作为一名珠宝商，他的工作也变得困难而痛苦。 他说：我的手卷成一团并且僵硬，我的脸上和脖子上的皮肤都变硬，我无法转动我的脖子，甚至不能转动身躯。步行超过20步几乎变得不可能。」他还失去了开车的能力，因为他的膝盖不能弯曲，无法踩到刹车或者油门。 之前没有任何治疗方法可以阻止这一疾病的发展。他的医生认为他只有几个月的活命时间。导致这种自身免疫性疾病原因不清楚，而疾病最终会袭击肺部和其他内脏。 慕斯卡特开始研究在加拿大、美国和欧洲进行的干细胞治疗测试。他通过加拿大干细胞基金会（Canadian Stem Cell Foundation）找到了艾金斯医生（Dr. Harry Atkins），艾金斯是渥太华医院（Ottawa Hospital）的干细胞治疗专家，他愿意为慕斯卡特治疗。 艾金斯表示，对于合适的病人来说，这一治疗方法确实对改善他们的生活质量有重要影

响。一旦免疫系统能够正常运作并且停止损伤皮肤，皮肤就会自愈。为硬皮病做干细胞移植在加拿大还是很新的事物。其他国家特别是在欧洲对此作出很多研究，而效果令人鼓舞。艾金斯医生曾经为其他自身免疫性疾病做过干细胞移植，例如多发性硬化病、僵硬人综合症、重症肌无力等。 慕斯卡特是加拿大首个运用在美国和欧洲得到测试的治疗方法的病例。该治疗方法从去年6月开始，医生们从慕斯卡特身上获取干细胞。然后使用强效的化疗药物，杀死导致他出现硬皮病的失效免疫系统。经过淨化的干细胞重新植入他身体内，目标是重新启动他的免疫系统，以便能够停止他的疾病。 慕斯卡特说，自从接受治疗以来，身体一天天好起来。他发现从6月以来，他的动作有所改善，紧绷情况已经消失。他逐渐可以恢复使用自己双手，现在又可以开始驾驶他心爱的赛车。 加拿大干细胞基金会的总裁兼首席执行官普莱斯（James Price）表示，对那些目前没有其他治疗方法的多种疾病患者来说，干细胞治疗能够给他们带来希望。普莱斯说，基金会的目标是能够在10年内令新的干细胞治疗方法得到运用。 该基金会指出，有证据显示，干细胞移植可以令其他严重自身免疫性疾病例如多发性硬化病、狼疮、类风湿关节炎等疾病的情况得到持续缓解。干细胞疗法现在也正在被研究用于治疗肌萎缩性侧索硬化、感染性休克、骨关节炎、糖尿病、黄斑变性等疾病。 在慕斯卡特的病情明显缓和之后，加拿大的其他干细胞治疗中心将会考虑为那些符合相关治疗条件的硬皮病患者提供这种治疗方法，为其他遭受这一疾病折磨的病人们带来希望。

骨髓间充质干细胞的分离与培养

骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ

间充质干细胞在体内的作用机制

间充质干细胞在体内的作用机制 摘要：随着细胞组织工程的研究不断深入，对干细胞在体内机制的不断了解研究，21世纪在全球多个国家药品管理局批准了干细胞制剂进入临床运用，为传统医药无法治疗和控制的疾病，提供了新的治疗途径，本文主要介绍现已广泛应用于临床的间充质干细胞制剂的作用机制。 关键词：间充质干细胞；作用机制 干细胞技术研究为人类疾病的治疗提供的新的途径、方法和手段，干细胞在生命科学、新药试验和疾病研究这三大生物医药领域发挥重要作用。目前，临床应用最为广泛之一的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员。它可以在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 一、间充质干细胞的治疗作用机制 1.归巢作用 MSC的归巢作用可能与以下几个方面有关： 1.1.表达大量趋化因子和趋化因子受体（CXCR4）并且能够通过向炎症趋化因子和细胞因子迁移归巢到炎症部位[1，2]。 1.2.MSC表面的CD44使间充质干细胞与内皮细胞上的E-选择蛋白结合从而归巢到含内皮细胞的炎症部位[3]。 1.3.整联蛋白和黏附因子（ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、ALCAM）参与间充质干细胞与内皮细胞的结合[4，5]。 2.免疫调节作用（主要为免疫抑制）[6] MSC可能先通过免疫激活的T细胞释放IFNγ、TNFα和IL-1等细胞因子，进而刺激MSC产生大量不同趋化因子和一氧化氮（nitric oxide，NO）；趋化因子招募T细胞向MSC聚集，MSC生成的NO抑制T细胞增殖，产生免疫抑制效果。 3.抗炎作用 3.1.MSC可能通过CD4+CD25+FOX P3+Treg细胞和IL1-RA表达来抑制IL-1?因子的作用。

间充质干细胞培养大全.

1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与 β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 １、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境 ５、细胞培养板得选择 6. 如何选用细胞培养基? 7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S ) 10.细胞得细菌、真菌污染及排除 就是否需要灭活? １１、细胞培养污染得预防 1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型? S胰酶 １5、干细胞得种类与表面标记 18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化? 理 20。冷冻保护剂作用与选择 1９、细胞传代消化过程指导? 21。细胞冻存指导 2２。干细胞冷冻与复苏 2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。? 2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。? 2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 (1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控 在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少

造血干细胞移植患者的饮食护理

造血干细胞移植患者的饮食护理 发表时间：2016-01-27T15:02:30.397Z 来源：《解放军预防医学杂志》2015年第7期供稿作者：张小花[导读] 徐州医学院附属淮安医院有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 徐州医学院附属淮安医院江苏淮安 223002 【摘要】目的探讨饮食护理对造血干细胞移植病人营养状况的影响。方法将2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例随机分为观察组16例和对照组15例。观察组在常规护理干预下进行饮食护理干预，对照组进行常规护理干预，观察两组患者造血功能恢复时间、体重增加情况，以评价患者的营养状况。结果有效的饮食护理干预，可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，减少患者的住院天数，使患者造血功能尽快恢复，减轻患者的经济负担。结论有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 【关键词】造血干细胞移植; 饮食护理 中图分类号 R473.5 文献标识码 B 目前随着社会的发展血液系统肿瘤发生率逐年增加，随着人们意识水平、经济水平及医学水平的提高，造血干细胞移植在我国广泛开展，造血干细胞移植患者越来越多，造血干细胞移植患者的营养状况对患者的造血重建，免疫功能恢复及移植后生存质量有重要意义。多数造血干细胞移植患者及家属只注重临床药物治疗而轻视饮食护理。据有关报道[1]患者在良好的饮食方式和营养状况下，较能承受肿瘤及其治疗对身体所产生的种种压力，同时接受化疗效果也会更好，相对来说移植成功率会提高，移植效果就会更好，因此做好造血干细胞移植患者的饮食护理，对移植的成功及移植后患者控制体重，术后恢复造血功能至关重要。我科对2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人进行饮食护理干预，并通过移植后患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况，现报道如下1资料与方法 1.1一般资料。2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例，年龄6-59岁，其中自体造血干细胞移植5例，异基因造血干细胞移植26例，随机分给观察组16例和对照组15例。 1.2方法。观察组每天与患者主动沟通了解患者饮食习惯，食欲情况，医嘱饮食要求，对患者整体评价后制定饮食计划，与家属沟通食物品种，烹饪方法。对照组实施常规护理干预及健康宣教，观察两组患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况。2结果 对31例造血干细胞移植患者进行有效的饮食护理干预可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，保证移植的成功率。3讨论 3.1影响进食的因素：（1）特殊的病室环境，移植期间患者独居无菌层流净化仓，没有亲人的陪伴，以及对造血干细胞移植术的担心。（2）造血干细胞移植术前患者经过超剂量的放化疗预处理，对患者胃肠功能造成伤害，患者产生呕吐症状，食欲下降，进食明显减少。（3）因患者预处理期间体质虚弱，卧床休息，活动量减少，肠蠕动减慢，饥饿感下降。（4）急性移植物抗宿主病消化道反应影响消化功能，降低食欲。 3.2宣教饮食护理的重要性 移植前，加强与患者及家属的沟通，稳定患者的情绪，建立良好的护患关系，向患者及家属宣教充足的营养是造血干细胞移植成功的前提，破除饮食与食物致病的封建迷信的传统思想习惯，对这样的患者及家属要赖心的宣教，以保证患者能获取更全面的营养。 3.3饮食的消毒方法 为保证患者食物的无菌，患者的食物必须经过微波炉高火加热7分钟，告知患者家属选用微波炉专用的筷子、勺子、饭盒或器皿，所有食物必须装在饭盒中递给护理人员，如为馒头、包子、饺子等水分少的食物，放在蒸霸中隔水加热，水果应该洗干净去皮，剁成小块，煮成水果汤，进仓后护理人员再次高火加热，煮鸡蛋应该剥壳捣碎后递给护理人员，防止微波炉加热时发生爆炸，食物不要装的过满，防止经过微波炉长时间的高温加热而溢出，耽误病人的进食时间，也避免家属对护理人员的误解。患者预处理期间进食会减少，剩下的的食物禁止再次递给护理人员，必须重新再做食物。患者喝的水必须是二次烧开的水，避免进食或进水带给患者细菌。保证患者的食物及水的无菌。 3.4造血干细胞移植前饮食护理 正确指导家人配合做好饮食护理，注意饮食卫生，水果、蔬菜要洗干净，变质的食物勿食用，勿食生、冷、油炸、刺激性食物。食物必须新鲜，家人自己烹饪，勿食加工食物及零食，不可重复食用，避免消化道感染。饮食原则以清淡、易消化、高蛋白、高热量、为主，定时、定量，少量多餐，注意品种多样化及色彩的搭配，增加患者的食欲，经常食用瘦肉、蛋类、牛奶、鱼类（没有鱼刺），多食新鲜水果及蔬菜，不易消化的食物、产气食物勿吃如：糯米面加工的食物，红薯，洋葱、大蒜、大蒜黄、韭菜、韭菜黄、，没有发酵的面食。预处理期间由于超剂量放化疗，患者会有呕吐症状，告知患者呕吐后仍需坚持进食，呕吐后进食可中和胃酸，促进肠蠕动，减轻对胃黏膜的刺激，帮助患者建立合理的饮食结构。进食与化疗时间间隔大于2小时[2]可以减轻恶心呕吐。这时候应少量多餐，两餐之间可以吃些不易引起恶心的辅助食物，饮食宜清淡，勿油腻，调料品种不宜过多，少量多餐，做好患者及家属心里沟通，鼓励患者进食，指导患者保持情绪乐观，介绍造血干细胞移植成功的病例，使患者树立战胜疾病的信心，让患者听轻音乐，集中治疗和护理，为患者提供舒适的进餐环境。如果患者进食量仍然很少及时与患者的床位医生沟通，通过静脉输液补充维生素及氨基酸，防止加重患者的营养不良，以免影响治疗效果。化疗后4-8天易发生口腔溃疡，其发生率为83.7%[3]，口腔溃疡影响进食，因此要做好口腔护理，做口腔护理时要用手电筒及压舌板仔细检查口腔情况，动作轻缓，避免人为损伤引起出血，指导患者每日晨起、饭前、饭后、睡前，用预防细菌和真菌感染的漱口液交替漱口，每次漱口用舌头上下、左右、里外、前后，反复搅拌，每种漱口液每次含漱时间大于3分钟。发生口腔溃疡时宜进温流食、半流食。口腔溃疡疼痛影响进食时，可用2%利多卡因漱口。预处理期间患者的血小板会降低，指导家人烹饪食物勿过干、过硬、带骨、带刺、宜流质或半流质。预处理期间患者的血红蛋白也会下降，指导家人给予患者多食补血的食物及水果如：菠菜、芹菜、红豆、红枣、花生、黑米、紫米、枸杞、龙眼、黑芝麻、南瓜、石榴、橘子、猕猴桃等，患者食欲下降的时候可以将这些食物烹饪成粥或者汤类。指导患者多食粗纤维的食物及水果，多饮水，保持大便通畅，预防便秘。

造血干细胞移植全程护理

造血干细胞移植全程护理 雷　静 关键词：造血干细胞；移植；护理 中图分类号：Ｒ４７３．６ 文献标识码：Ｃ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－４７４８．２０１２．０２７．０４２ 文章编号：１６７４－４７４８（２０１２）９Ｃ－２５４９－０３ 造血干细胞移植（ＨＳＣＴ）依造血干细胞的来源可分为骨髓移植、外周血干细胞移植和脐带血移植等；根据供体与受体的关系又可分为自体移植和异基因移植。ＨＳＣＴ是目前治疗白血病、淋巴瘤等血液系统恶性疾病的最有效方法，也是治疗某些免疫系统疾病、遗传性疾病、代谢疾病尤其是某些实体瘤的根本途径。在治疗过程中，护理质量是ＨＳＣＴ成功的一个关键环节，护理重点包括全环境保护措施的实施、干细胞采集及回输的护理、预处理期的护理、移植后并发症的观察与护理、心理护理。现将ＨＳＣＴ全程护理综述如下。 １　全环境保护措施的实施 全环境保护（ｔｏｔａｌ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＴＥＰ）指采取必要的措施，达到体内外环境的高度净化，从而预防和减少感染的发生，包括空间环境和人体环境净化两个方面。空间环境指病人所处的整个外部生活空间，尽管各医院根据具体环境与条件有不同的布局设置，但基本要求相同，即达到空间环境的最佳净化。人体环境包括病人的体表环境与体内环境，凡是能与空气直接接触的人体部位，如全身皮肤、指（趾）甲缝、毛发、眼、耳、鼻腔、口腔、咽部、呼吸道、肛周以及会阴部均属体表环境，是微生物侵入机体的屏障；体内环境包括胃肠系统、循环系统、各组织器官及浆膜腔等，是内源性感染的主要场所［１］。ＴＥＰ的具体内容是：层流无菌室（ｌａｍｉｎａｒ　ａｉｒｆｌｏｗ　ｂｉｏｃｌｅａｎ　ｒｏｏｍ，ＬＡＦＲ）的应用；病人体表的无菌化护理；病人肠道净化；医护人员自身净化；系统的微生物监测［２］。已有研究显示，对病人采取全环境保护措施，能使总感染率下降，感染日数缩短［３］。 １．１　ＬＡＦＲ的应用　ＬＡＦＲ的空气通过高效过滤器的过滤，可以清除９９．９７％以上的直径大于０．３ｕｍ的微粒和细菌，降低空气感染率，但高效过滤器本身并无灭菌功能，不能解决接触感染问题，因此ＬＡＦＲ的应用效果与科学的管理密切相关。建立层流病房环境规范化管理标准，对工作人员进行环境管理培训，培训合格者方可进入ＬＡＦＲ单独上岗。１．２　病人体表的无菌化护理　入住层流无菌室前１ｄ协助病人剪短指（趾）甲，剃除全身毛发，清洁沐浴；入室当天用１∶２　０００氯己定液药浴２０ｍｉｎ，浸泡时注意擦洗腋下、脐部、外阴部及皮肤皱褶处；入室后每日用１∶２　０００氨己定液擦浴，更换无菌病号服、帽子，每次便后用０．０２５％碘伏液坐浴，饭前、便后用７５％乙醇擦手。五官护理：呼吸道感染在很大程度上是病原体从鼻咽部下行引起的［４］。给病人用利福平和氯霉素眼药水交替滴眼，呋麻滴鼻液滴鼻，左氧氟沙星滴耳液滴耳，用５％碳酸氢钠和复方硼砂漱口液交替含漱，饭后行口腔护理，每日３次。 １．３　病人肠道净化　入室前３ｄ开始进行肠道清洁准备，口服诺氟沙星、小檗碱、氟康唑等肠道抗生素；入室后进无菌饮食：病人饭菜采用双蒸法消毒后食用，每次餐具也同时消毒；水果用１∶２　０００氯己定液浸泡３０ｍｉｎ，用无菌刀削皮后食用；口服药片用紫外线照射，两面各３０ｍｉｎ。 １．４　医护人员自身净化　为减少工作人员自身带菌率，参考李芳等［５］的临床实践制订工作人员进入ＬＡＦＲ的流程：进入１室洗手，更换无菌手术衣，戴一次性口罩、帽子，换鞋→入１０　０００级２室，用免洗型手消毒液洗手（着短袖手术衣时洗至肘上１０ｃｍ处），换鞋→入１　０００级３室→再戴一层口罩、帽子，再次用免洗型手消毒液洗手，穿无菌隔离衣、脚套，换鞋→入１００级室执行治疗、护理。 １．５　系统的微生物监测　按医院感染管理科要求，每季度对层流病房的空气、物品、使用中消毒剂和医务人员的手进行微生物检测，要求达到Ⅰ类环境空气、物表、医务人员手卫生标准。另外，每位病人药浴后均取口、鼻、耳、腋窝、肛周及会阴部位拭子进行微生物检测。 ２　干细胞采集及回输的护理 外周血造血干细胞移植具有采集简单方便、病人造血和免疫功能恢复快、节省费用等优点，已经成为越来越多恶性血液病病人的主要治疗手段［６］。但在采集过程中会有不同程度的不良反应发生，主要有枸橼酸钠毒性反应，低血容量，发热反应，继发性贫血、血小板减少性紫癜、感染等［７］。杨便红等［８］报道在外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）采集前给予有针对性的护理干预，可以显著减少不良反应的发生率，并且有可能减少采集的次数，提高ＰＢＳＣ采集的质量，为顺利进行干细胞移植奠定基础。对干细胞采集者提高采集前、中、后的全程护理，以确保采集到高品 质