中空纤维在病毒类疫苗中的应用
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(1) 生产规模小，产能不足
我国人口众多，人民群众对各种疫苗的需求增长迅速。而国内疫苗生产规模普遍较小，产能较低，难以满足疫苗规模化 生产的需求。以狂犬灭活疫苗为例，国内部分厂家已经采用多个30L或14L小规模搅拌生物反应器结合微载体技术进行细 胞培养平行放大代替转瓶工艺，但是多个反应器操作仍较繁琐，难以保证不同亚批产品的质量均一性，同时增加了工艺 验证的难度。 新型WAVE生物反应器结合微载体细胞培养技术和球转球放大工艺为贴壁细胞规模化培养和放大提供了可能性，使用较 大规模的生物反应器可以显著降低工作强度，减少生产批次和过程控制，提高产能和快速响应能力。目前WAVE已经成 功的用于细胞流感疫苗、脊髓灰质炎、昆虫细胞VLP 新型疫苗 (Novavax, Inc) 等；2005年，以新型天花疫苗和治疗性HIV 疫苗著称的丹麦Bavarian Nordic 公司将WAVE 1000 成功的用于新型MVA疫苗的GMP生产 [5]。 中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的现代膜分离技术，寿命长成本低、可以直接线性放大，满足疫苗的大规模生产纯 化需要。
图2 中空纤维膜开放式的流道结构
中空纤维膜按孔径分为超滤膜和微滤膜，孔径齐全：超滤中空纤维膜(如750k)常用于蛋白质或病毒颗粒温和快速的浓缩； 而微滤中空纤维膜( 如 0.45μm, 0.65um )可以直接用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析柱前料液的澄清，省去 离心过滤等预处理步骤。中空纤维膜具有良好的物理化学耐受性，超滤中空纤维膜入口耐压大于4bar，可以在50度下耐 受1M NaOH/300ppm NaClO进行彻底清洗，大多数中空纤维膜还可以高压灭菌，寿命长，成本低[9]。
Manual Run 1:10_UVManual Run 1:10_UVManual Run 1:10_Inject mAu
1500
Blue: 300k Cassette, Rabies 14.8%, Rs 2.43
Red: 750k Hollow fiber, Rabies 22%, Rs 2.53
(3) 对新技术需求迫切
新技术不断涌现为疫苗的发展提供新的方向和发展趋势，如昆虫细胞/杆状病毒新型基因工程重组VLP疫苗、病毒载体疫 苗、DNA疫苗、联合疫苗、口服疫苗、治疗性疫苗和新型佐剂等逐渐成为研究热点。 GE Life Sciences作为生物制药行业的领先者，和国内外知名制药公司/研究院所紧密合作，不断开发新的产品和应用，提 供从上游大规模细胞培养、中空纤维切向流过滤、层析精细纯化以及 Biacore分析质控在内的病毒类疫苗整体解决方案 [6,7]。
图3 通用的病毒疫苗生产工艺
病毒超滤浓缩通常使用100-300k膜包，膜包筛网剪切力易造成病毒颗粒聚集和表面蛋白的脱落，从而影响病毒活性收率， 因此对操作要求极高；此外，膜包筛网剪切力还容易加速杂蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k 较小的膜包孔径不利于浓缩过程中杂蛋白透过，因此浓缩液杂蛋白含量在浓缩过程中不断增加，蛋白凝胶层显著影响浓 缩处理速度，较高的黏度也不利于后期4FF分离纯化和填料寿命。
2.2 中空纤维膜过滤技术在病毒疫苗中的应用
中空纤维膜开放式流道解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法以 有效保护病毒颗粒的完整性，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命科学研究领域[10]。 中空纤维750k超滤膜采用先进的膜加工制造工艺，具有均一的孔径分布，有效截留病毒的同时避免病毒在膜上的沉积， 速度快收率高，同时较大的孔径使得DNA和杂蛋白等杂质透过而加以去除，降低浓缩后的料液黏度，提高产品质量[16]。 美国默克公司将中空纤维过滤膜用于多种疫苗的生产，如使用300k中空纤维膜进行重组酵母乙肝疫苗的浓缩和洗滤，使 用0.65μm 中空纤维膜澄清酵母裂解液生产HPV疫苗等[11]。 Bernd Kalbfuss 等人将750k中空纤维膜用于MDCK细胞流感病毒培养液的浓缩，发现中空纤维750k超滤膜可以有效去除宿 主DNA等杂质 [12,13]。C. Peixoto 等使用中空纤维750k浓缩轮状病毒的昆虫细胞培养液，优化后的浓缩收率达86%，浓缩 的同时去除97%的DNA。最终得到高纯度的轮状病毒VLP类病毒颗粒, 工艺总收率37% [14]。 中空纤维化学稳定性极佳，寿命长，单位膜面积成本低，也广泛用于口蹄疫、狂犬等兽用病毒类疫苗的浓缩，改善产品 质量。吕洪亮等在2009年成功的使用750k中空纤维进行兽用狂犬疫苗的浓缩，研究结果表明：相比100k和500k的超滤膜， 750k中空纤维膜可以充分截留狂犬病毒，实现高抗原收率，同时有效去除牛血清白蛋白，提高疫苗的安全性、有效性和 稳定性。最终成功建立了Cytodex 1微载体细胞培养、中空纤维750k浓缩、Sepharose 6FF层析纯化的高质量兽用狂犬疫苗 生产新工艺 [15]。目前采用此工艺的纯化兽用灭活狂犬疫苗已经获得新兽药证书正式投产。
1.病毒类疫苗的发展和面临的挑战
在人类与各种疫病的长期斗争过程中，没有任何其它医疗措施能像疫苗一样对人类的健康产生如此重大影响，也没有任 何其它的治疗药品能像疫苗一样以其低廉代价把某种疾病从地球上消灭[1]。 近年国内外生物技术不断发展，出现多个年销售额超过10亿美元的重磅炸弹疫苗药物，如流感疫苗、肝炎疫苗、宫颈癌 疫苗和肺炎多糖疫苗等。2008年到2010年全球疫苗年复合增长率超过14%，2009年全球疫苗总产值超过220亿美元，全 球疫苗总产值在2012年预计将突破400亿美元[2]。国内疫苗市场在2009年也超过13亿美元，且以20%以上的速度复合增 长，2009年SFDA疫苗批签发超过10亿剂量 ，病毒类疫苗约占60% [3]。 国内疫苗产业发展迅速，拥有近40家疫苗企业可以生产约50种疫苗药物，目前已建成年产超过1.6亿剂量的甲流疫苗生产 线 [4]。但与此同时，国内疫苗企业也面临着诸多严峻挑战：
实验设备：
Quixstand 中空纤维卫生级超滤系统（可整体高压灭菌）
AKTA Purifier10 层析仪
中空纤维超滤柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2 (750kDa MWCO，GE)
Cassette 300k膜包0.1m2（某进口品牌）
检测方法：
LD50病毒滴度(药典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目测外观
2.中空纤维膜过滤技术
2.1中空纤维膜过滤原理简介
中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration, TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration， CFF），其操作原理如图1：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔 径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离[8]。
中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用
Application of Hollow Fiber Filtration Technology in Virus VaBaidu Nhomakorabeacine Production
苗景赟 王奕军 (通用电气医疗集团 GE Life Sciences)
生命科学和生物技术的日新月异对疫苗的发展提供了新的契机：疫苗快速规模化生产、质量标准不断提高以及新技术的 开发应用成为行业的技术发展趋势。 新型中空纤维膜过滤技术具有温和低剪切力、容尘量高、操作灵活、寿命长成本低、易于放大等优点，解决了病毒颗粒 浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命 科学研究领域。本文详述了中空纤维在狂犬疫苗和流感疫苗中的成功应用，结果表明新型中空纤维膜过滤技术有利于改 进疫苗产品质量、提高生产效率。 将中空纤维膜过滤技术、新型WAVE波浪生物反应器和微载体细胞球转球放大培养工艺以及高选择性层析新填料技术相结 合，可以更好的适应疫苗大规模生产的挑战。
使用750k中空纤维和300k膜包浓缩过程的通量-透过体积曲线见下图(Flux-Permeate Vol)。使用中空纤维750k超滤柱进行狂犬 病毒培养液浓缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程需要1小时16分，平均处理通量61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k进行浓 缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程历时1小时20分，平均处理通量49 LMH。
中空纤维750k
图4 通量-透过体积曲线
膜包300k
5
3.1.3 讨论 使用Sepharose 4FF分子筛分析柱对浓缩液进行分析，快速检定浓缩液中杂质的残留，并比较病毒和杂质的分离情况，结果 见图5所示。 使用两种不同的超滤膜进行浓缩，所得浓缩液中病毒颗粒的积分面积相当，因此750k中空纤维和300k膜包都可以很好的截 留病毒颗粒；然而，中空纤维750k的浓缩液中小分子面积较小，表明750k中空纤维可以使更多的小分子杂蛋白/核酸等杂质 透过加以去除，在浓缩的同时提高产品的纯度，这一点也直观的表现在750k所得病毒浓缩液外观更加澄清、黏度较低。
1，料液储罐 2，Feed (入口端)压力表 3，Retentate (回流端)压力表 4，Permeate (透过端)压力表 5，料液/缓冲液补料口
图1 切向流膜过滤原理示意图
2
和传统的平板膜包相比，中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构(图2)，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则 剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护大分子 病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。
Mem brane s
中空纤维 750k 膜包 300k
Area (m2 )
0.085
0.1
S ample (L)
6
6
Load (L /m2)
70
60
Crossflow (L/min)
1
1
TMP (psi)
5
5
CF when dia *
20x
20x
DF ( 滤洗倍数 )
3x
3x
* 指开始滤洗时的浓缩倍数
3
3.中空纤维浓缩病毒培养液实例
相对于其他杂蛋白和DNA等杂质，病毒颗粒具有较大的分子量，因而可以使用超滤膜过滤和分子筛等技术按照分子量大小 进行分离分级，建立通用的病毒纯化工艺。病毒类疫苗通常使用微载体细胞培养技术进行病毒培养，一定滴度的病毒培 养收获液通过1-2um玻璃纤维GF澄清过滤去除细胞碎片和部分DNA，超滤膜浓缩10-80倍，经灭活水解之后使用Sepharose 4FF或6FF分子筛层析按照分子量大小进行精细纯化。[16]。
4
3.1.2 实验结果 我们分别使用中空纤维750k超滤柱(GE)和300k超滤膜包(某进口品牌) 进行狂犬病毒收获液的浓缩，考察处理速度、病毒颗 粒收率和浓缩液澄清度等指标。除病毒滴度外，浓缩液使用Sephorase 4FF 16/40分子筛分析柱进行分析，快速检测比较杂 质残留。
表1狂犬病毒培养液超滤浓缩实验条件
1
(2) 疫苗质量亟需提高
疫苗广泛使用于广大健康人群，因此对疫苗产品的安全性要求极高，国家药监部门也不断提高多种疫苗的质量控制标准， 提高疫苗质量已经成为生产过程控制的关键。然而，国内部分疫苗仍采用较传统的生产工艺，如转瓶培养、绢布过滤、 透析等，迫切需要引入新的现代生物技术对现有生产工艺进行改进。 中空纤维膜分离技术提供更均一的膜孔径和低剪切力，通过对过程参数的优化和控制，不仅有利于保护病毒大分子的活 性，还可以更好的去除各种杂质，提高产品质量，显著改善生产效率，成功的代替绢布过滤和透析等操作。
3.1 狂犬病毒培养液的浓缩
狂犬病毒属于弹状病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是诱发细胞与体液免疫的主 要抗原物质[17]。超滤浓缩过程中需要尽量温和以避免G蛋白的脱落，保护病毒的免疫原性，同时尽可能去除杂蛋白和DNA 片断。
3.1.1 实验条件
样品：
澄清病毒收获液 (CTN株，Vero细胞Cytodex 1微载体连续 培养，Lot20090401)
我国人口众多，人民群众对各种疫苗的需求增长迅速。而国内疫苗生产规模普遍较小，产能较低，难以满足疫苗规模化 生产的需求。以狂犬灭活疫苗为例，国内部分厂家已经采用多个30L或14L小规模搅拌生物反应器结合微载体技术进行细 胞培养平行放大代替转瓶工艺，但是多个反应器操作仍较繁琐，难以保证不同亚批产品的质量均一性，同时增加了工艺 验证的难度。 新型WAVE生物反应器结合微载体细胞培养技术和球转球放大工艺为贴壁细胞规模化培养和放大提供了可能性，使用较 大规模的生物反应器可以显著降低工作强度，减少生产批次和过程控制，提高产能和快速响应能力。目前WAVE已经成 功的用于细胞流感疫苗、脊髓灰质炎、昆虫细胞VLP 新型疫苗 (Novavax, Inc) 等；2005年，以新型天花疫苗和治疗性HIV 疫苗著称的丹麦Bavarian Nordic 公司将WAVE 1000 成功的用于新型MVA疫苗的GMP生产 [5]。 中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的现代膜分离技术，寿命长成本低、可以直接线性放大，满足疫苗的大规模生产纯 化需要。
图2 中空纤维膜开放式的流道结构
中空纤维膜按孔径分为超滤膜和微滤膜，孔径齐全：超滤中空纤维膜(如750k)常用于蛋白质或病毒颗粒温和快速的浓缩； 而微滤中空纤维膜( 如 0.45μm, 0.65um )可以直接用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析柱前料液的澄清，省去 离心过滤等预处理步骤。中空纤维膜具有良好的物理化学耐受性，超滤中空纤维膜入口耐压大于4bar，可以在50度下耐 受1M NaOH/300ppm NaClO进行彻底清洗，大多数中空纤维膜还可以高压灭菌，寿命长，成本低[9]。
Manual Run 1:10_UVManual Run 1:10_UVManual Run 1:10_Inject mAu
1500
Blue: 300k Cassette, Rabies 14.8%, Rs 2.43
Red: 750k Hollow fiber, Rabies 22%, Rs 2.53
(3) 对新技术需求迫切
新技术不断涌现为疫苗的发展提供新的方向和发展趋势，如昆虫细胞/杆状病毒新型基因工程重组VLP疫苗、病毒载体疫 苗、DNA疫苗、联合疫苗、口服疫苗、治疗性疫苗和新型佐剂等逐渐成为研究热点。 GE Life Sciences作为生物制药行业的领先者，和国内外知名制药公司/研究院所紧密合作，不断开发新的产品和应用，提 供从上游大规模细胞培养、中空纤维切向流过滤、层析精细纯化以及 Biacore分析质控在内的病毒类疫苗整体解决方案 [6,7]。
图3 通用的病毒疫苗生产工艺
病毒超滤浓缩通常使用100-300k膜包，膜包筛网剪切力易造成病毒颗粒聚集和表面蛋白的脱落，从而影响病毒活性收率， 因此对操作要求极高；此外，膜包筛网剪切力还容易加速杂蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k 较小的膜包孔径不利于浓缩过程中杂蛋白透过，因此浓缩液杂蛋白含量在浓缩过程中不断增加，蛋白凝胶层显著影响浓 缩处理速度，较高的黏度也不利于后期4FF分离纯化和填料寿命。
2.2 中空纤维膜过滤技术在病毒疫苗中的应用
中空纤维膜开放式流道解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法以 有效保护病毒颗粒的完整性，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命科学研究领域[10]。 中空纤维750k超滤膜采用先进的膜加工制造工艺，具有均一的孔径分布，有效截留病毒的同时避免病毒在膜上的沉积， 速度快收率高，同时较大的孔径使得DNA和杂蛋白等杂质透过而加以去除，降低浓缩后的料液黏度，提高产品质量[16]。 美国默克公司将中空纤维过滤膜用于多种疫苗的生产，如使用300k中空纤维膜进行重组酵母乙肝疫苗的浓缩和洗滤，使 用0.65μm 中空纤维膜澄清酵母裂解液生产HPV疫苗等[11]。 Bernd Kalbfuss 等人将750k中空纤维膜用于MDCK细胞流感病毒培养液的浓缩，发现中空纤维750k超滤膜可以有效去除宿 主DNA等杂质 [12,13]。C. Peixoto 等使用中空纤维750k浓缩轮状病毒的昆虫细胞培养液，优化后的浓缩收率达86%，浓缩 的同时去除97%的DNA。最终得到高纯度的轮状病毒VLP类病毒颗粒, 工艺总收率37% [14]。 中空纤维化学稳定性极佳，寿命长，单位膜面积成本低，也广泛用于口蹄疫、狂犬等兽用病毒类疫苗的浓缩，改善产品 质量。吕洪亮等在2009年成功的使用750k中空纤维进行兽用狂犬疫苗的浓缩，研究结果表明：相比100k和500k的超滤膜， 750k中空纤维膜可以充分截留狂犬病毒，实现高抗原收率，同时有效去除牛血清白蛋白，提高疫苗的安全性、有效性和 稳定性。最终成功建立了Cytodex 1微载体细胞培养、中空纤维750k浓缩、Sepharose 6FF层析纯化的高质量兽用狂犬疫苗 生产新工艺 [15]。目前采用此工艺的纯化兽用灭活狂犬疫苗已经获得新兽药证书正式投产。
1.病毒类疫苗的发展和面临的挑战
在人类与各种疫病的长期斗争过程中，没有任何其它医疗措施能像疫苗一样对人类的健康产生如此重大影响，也没有任 何其它的治疗药品能像疫苗一样以其低廉代价把某种疾病从地球上消灭[1]。 近年国内外生物技术不断发展，出现多个年销售额超过10亿美元的重磅炸弹疫苗药物，如流感疫苗、肝炎疫苗、宫颈癌 疫苗和肺炎多糖疫苗等。2008年到2010年全球疫苗年复合增长率超过14%，2009年全球疫苗总产值超过220亿美元，全 球疫苗总产值在2012年预计将突破400亿美元[2]。国内疫苗市场在2009年也超过13亿美元，且以20%以上的速度复合增 长，2009年SFDA疫苗批签发超过10亿剂量 ，病毒类疫苗约占60% [3]。 国内疫苗产业发展迅速，拥有近40家疫苗企业可以生产约50种疫苗药物，目前已建成年产超过1.6亿剂量的甲流疫苗生产 线 [4]。但与此同时，国内疫苗企业也面临着诸多严峻挑战：
实验设备：
Quixstand 中空纤维卫生级超滤系统（可整体高压灭菌）
AKTA Purifier10 层析仪
中空纤维超滤柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2 (750kDa MWCO，GE)
Cassette 300k膜包0.1m2（某进口品牌）
检测方法：
LD50病毒滴度(药典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目测外观
2.中空纤维膜过滤技术
2.1中空纤维膜过滤原理简介
中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration, TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration， CFF），其操作原理如图1：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔 径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离[8]。
中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用
Application of Hollow Fiber Filtration Technology in Virus VaBaidu Nhomakorabeacine Production
苗景赟 王奕军 (通用电气医疗集团 GE Life Sciences)
生命科学和生物技术的日新月异对疫苗的发展提供了新的契机：疫苗快速规模化生产、质量标准不断提高以及新技术的 开发应用成为行业的技术发展趋势。 新型中空纤维膜过滤技术具有温和低剪切力、容尘量高、操作灵活、寿命长成本低、易于放大等优点，解决了病毒颗粒 浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命 科学研究领域。本文详述了中空纤维在狂犬疫苗和流感疫苗中的成功应用，结果表明新型中空纤维膜过滤技术有利于改 进疫苗产品质量、提高生产效率。 将中空纤维膜过滤技术、新型WAVE波浪生物反应器和微载体细胞球转球放大培养工艺以及高选择性层析新填料技术相结 合，可以更好的适应疫苗大规模生产的挑战。
使用750k中空纤维和300k膜包浓缩过程的通量-透过体积曲线见下图(Flux-Permeate Vol)。使用中空纤维750k超滤柱进行狂犬 病毒培养液浓缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程需要1小时16分，平均处理通量61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k进行浓 缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程历时1小时20分，平均处理通量49 LMH。
中空纤维750k
图4 通量-透过体积曲线
膜包300k
5
3.1.3 讨论 使用Sepharose 4FF分子筛分析柱对浓缩液进行分析，快速检定浓缩液中杂质的残留，并比较病毒和杂质的分离情况，结果 见图5所示。 使用两种不同的超滤膜进行浓缩，所得浓缩液中病毒颗粒的积分面积相当，因此750k中空纤维和300k膜包都可以很好的截 留病毒颗粒；然而，中空纤维750k的浓缩液中小分子面积较小，表明750k中空纤维可以使更多的小分子杂蛋白/核酸等杂质 透过加以去除，在浓缩的同时提高产品的纯度，这一点也直观的表现在750k所得病毒浓缩液外观更加澄清、黏度较低。
1，料液储罐 2，Feed (入口端)压力表 3，Retentate (回流端)压力表 4，Permeate (透过端)压力表 5，料液/缓冲液补料口
图1 切向流膜过滤原理示意图
2
和传统的平板膜包相比，中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构(图2)，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则 剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护大分子 病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。
Mem brane s
中空纤维 750k 膜包 300k
Area (m2 )
0.085
0.1
S ample (L)
6
6
Load (L /m2)
70
60
Crossflow (L/min)
1
1
TMP (psi)
5
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CF when dia *
20x
20x
DF ( 滤洗倍数 )
3x
3x
* 指开始滤洗时的浓缩倍数
3
3.中空纤维浓缩病毒培养液实例
相对于其他杂蛋白和DNA等杂质，病毒颗粒具有较大的分子量，因而可以使用超滤膜过滤和分子筛等技术按照分子量大小 进行分离分级，建立通用的病毒纯化工艺。病毒类疫苗通常使用微载体细胞培养技术进行病毒培养，一定滴度的病毒培 养收获液通过1-2um玻璃纤维GF澄清过滤去除细胞碎片和部分DNA，超滤膜浓缩10-80倍，经灭活水解之后使用Sepharose 4FF或6FF分子筛层析按照分子量大小进行精细纯化。[16]。
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3.1.2 实验结果 我们分别使用中空纤维750k超滤柱(GE)和300k超滤膜包(某进口品牌) 进行狂犬病毒收获液的浓缩，考察处理速度、病毒颗 粒收率和浓缩液澄清度等指标。除病毒滴度外，浓缩液使用Sephorase 4FF 16/40分子筛分析柱进行分析，快速检测比较杂 质残留。
表1狂犬病毒培养液超滤浓缩实验条件
1
(2) 疫苗质量亟需提高
疫苗广泛使用于广大健康人群，因此对疫苗产品的安全性要求极高，国家药监部门也不断提高多种疫苗的质量控制标准， 提高疫苗质量已经成为生产过程控制的关键。然而，国内部分疫苗仍采用较传统的生产工艺，如转瓶培养、绢布过滤、 透析等，迫切需要引入新的现代生物技术对现有生产工艺进行改进。 中空纤维膜分离技术提供更均一的膜孔径和低剪切力，通过对过程参数的优化和控制，不仅有利于保护病毒大分子的活 性，还可以更好的去除各种杂质，提高产品质量，显著改善生产效率，成功的代替绢布过滤和透析等操作。
3.1 狂犬病毒培养液的浓缩
狂犬病毒属于弹状病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是诱发细胞与体液免疫的主 要抗原物质[17]。超滤浓缩过程中需要尽量温和以避免G蛋白的脱落，保护病毒的免疫原性，同时尽可能去除杂蛋白和DNA 片断。
3.1.1 实验条件
样品：
澄清病毒收获液 (CTN株，Vero细胞Cytodex 1微载体连续 培养，Lot20090401)