毛细管电泳测定阿片肽方法的探索

毛细管电泳测定阿片肽方法的探索

项目完成人员：董标董方霆梁月琴吴胜明杨征*

项目完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心

*中国人民解放军第307医院

摘要阿片肽是一类具有广泛作用的神经肽，放射免疫分析（RIA）是目前测定生物体内微量阿片肽的一种灵敏方法，但也存在诸多缺点。为了开辟阿片肽定量的新途径，我们以阿片肽的标准品（脑啡肽、强啡肽、β-内啡肽）为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。以荧光素异硫氰酸盐（FITC）为衍生化试剂，建立用毛细管区带电泳-激光诱导荧光检测测定亮氨酸脑啡肽（Leu-ENK）的方法，检测限达10-14mol，线性范围是35.2~563.1 fmol/μL，（n=7）r=0.9985。测得样品微透析液中脑啡肽的含量为7.4⨯10-15 mol/μL，并对串联质谱测定阿片肽的方法进行尝试。

阿片肽存在于哺乳动物的组织和体液中，作用极为广泛，具有镇痛、抑制呼吸和参与应激反应等功能，与学习和记忆、生殖内分泌、免疫功能的调节也密切相关[1]。阿片肽的定量测定最常用的方法是放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），它是通过专一活性（specific activity）高的示踪物，观察抗原与抗体结合反应产物来定量微量物质的一种分析方法。其缺点是一个抗体和其它肽的交叉免疫反应，限制了分子的专一性；其次放免试剂盒的成本较高，一种放免试剂盒只能测定其中一种阿片肽，操作复杂费时，使用时接触有生物毒性的放射性物质（如125 I），易对人体造成损害。毛细管电泳是上世纪80年代初迅速发展起来的一门分离分析技术，具有高效、快速、灵敏、样品用量少等特点，在生命科学、环境科学、食品科学、临床等领域有着广泛的应用[2-3]。毛细管电泳的分离模式众多，分离机理也各不相同，对样品来源受到限制的少量体积样品（如微透析液）分析，尤其是毛细管电泳-激光诱导荧光检测（CE-LIF），已成为首选技术。目前，CE-LIF 用于直接测定微透析液中物质主要集中在一些氨基酸和生物胺等小分子物质方面[4-5]，未见测定多肽、蛋白等生物大分子的报道。为了开辟阿片肽定量的新途径，对生物样品中微量的阿片肽能同时测定，我们以阿片肽的标准品（脑啡肽、强啡肽、β-内啡肽）为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。

一、实验部分

1.1仪器与试剂

P/ACE5000型毛细管电泳仪（Beckman 公司，美国），配有紫外-可见检测器和氩离

子激光诱导荧光检测器（λex = 488nm，λem = 513nm），Gold System数据处理系统；弹性石英毛细管柱，50、75μm内径，购自河北永年光导纤维厂。质谱仪为电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF 2，英国micromass公司；亮氨酸脑啡肽（Leu-ENK）纯度99%、含量79%，强啡肽A（DYN A）纯度99%、含量72%，β-内啡肽（β-EP）纯度99%、含量77%，均购自sigma公司；荧光素异硫氰酸盐（FITC）异构体Ι、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）为进口分装；四硼酸钠、硼砂、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。实验用水均为Milli-Q级，实验室自制。微透析液用微透析探针采自大鼠脑部的伏隔核区，分子量截留大于3500D，由合作单位提供。

1.2 缓冲液的配制

Tris-H3PO4缓冲液：称取一定量的Tris，水溶解后，用H3PO4调pH，定容至所需浓。

Tris-硼砂缓冲液：称取Tris和硼砂,适量水溶解后，用NaOH调pH，定容至所需浓度。

硼砂-硼酸缓冲液（含SDS）：称取适量硼砂、硼酸、SDS，加一定量的水溶解后，用NaOH调pH，定容至刻度。

1.3 标准品溶液的配制

精密称取一定量的阿片肽标准品，用去离子水溶解，配成浓度为1mg/mL的储备液，放-20℃保存，临用前稀释到所需的浓度。微透析液每次取5μL，未作任何处理，直接进行衍生化分析。

1.4样品的衍生化过程

所有衍生化过程都在200μL具塞离心管中进行。取一定量的样品液和0.2mol/L pH9.0碳酸钠盐缓冲液，衍生化时加入一定量的FITC溶液（0.2mg/mL，乙腈溶解，含1%甲醇、0.25‰吡啶v/v），涡旋混匀后避光室温反应12-14h。空白对照按相同方法配制，每次样品衍生化时均同时制备空白对照。

1.5电泳条件

柱子使用前用0.1mol/L的NaOH，H2O、运行缓冲液分别洗柱10min，每次进样前用H2O压力冲洗2min，缓冲液冲洗4min。每分析4-5次后更换新的运行缓冲液，UV或LIF 检测。

二、结果与讨论

2.1分离模式的选择

P/ACE5000型毛细管电泳仪配有检测器（波长200nm、214nm、254nm、280nm）和激光诱导荧光（LIF）检测器（λex/λem 488/520nm）。由于UV检测器的通用性，对于蛋白质、肽类样品不需要任何处理即可检测，我们首先用UV检测方法对阿片肽标准品进行分离。采用MEKC的分离模式对阿片肽标准品分别进样分离，仅Leu-ENK脑啡肽出现色谱峰。采用CZE分离，Leu-ENK、β-EP、DYN A在不同的保留时间出峰，混合后进样，三者能完全分开，见图1、2。在相同进样量情况下，Leu-ENK色谱峰的吸收强度约是MECC分离时的色谱峰强度的10多倍，故此确定CZE为分离模式。配制一系列不同浓度的阿片肽标准混合液，进行分离。阿片肽的UV最小检测限约为2⨯10-12 mol/μL。文献报道用RIA测定脑组织中内源性阿片肽的浓度仅为pg/mg的水平，UV检测的灵敏度远低于实际样品的含量。LIF检测是CE所有检测方法中灵敏度最高的一种方法。但是大多数物质的荧光量子产率很低，或不发荧光。特别是感兴趣的一些生物大分子，如氨基酸、多肽和多数蛋白质等。因此，需借助衍生或荧光标记技术，使待测组分转变为能发荧光的衍生物，提高检测灵敏度。不同的荧光试剂有不同的激发和发射波长，标记的对象也不尽相同。常用的荧光衍生试剂见表1–1。

表1–1 常用的荧光衍生试剂

衍生试剂激发和发射波长反应物

荧光素异硫氰酸盐（fluorescein isothiocyanate, FITC）λex 490nm

λem 519nm

氨基酸、多肽、蛋

白质

荧光胺（fluorecamine）λex 390nm

λem 450nm

伯氨基酸

邻苯二甲醛

（o-phthaldialdehyde，OPA）λex 350nm

λem 450nm

氨基酸、多肽、蛋

白质、胺

萘二醛衍生物

（naphthalene-2，3-dicarboxyaldehyde，NDA）λex 442nm

λem 490nm

氨基酸，多肽，生

物胺

3-（4-羧基甲酰基）-2-奎宁羧醛

[3-（4-carboxybenzoyl）-2-quinoline，CBQCA] λex 456nm

λem 552nm

氨基酸、多肽

四甲基罗丹明异硫氰酸盐（tetramethylrhodamine isothiocyanate，

TRITC）λex 543nm

λem 570 nm

氨基酸、多肽

异硫氰酸苯脂（phenyl-isothiocyanate，PITC）λex 290nm

λem 345nm

氨基酸、多肽、蛋

白质

9-芴基甲基氯甲酚酯

（9-fluorenylnethyl chloroformate，FMOC）λex 260nm

λem 305nm

氨基酸