对β-胡萝卜素测定方法的认识

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姓名：***

班级：应用化学122班

学院：化学工程学院

学校：新疆农业大学

对β-胡萝卜素测定方法的认识

摘要：食品中的β-胡萝卜素可以用纸上层析法、薄层色谱法、分光光度法及高效液相色谱法等方法测定。本文简述了这些方法的原理条件及优缺点，并谈了谈自己的认识。

Β-胡萝卜素作为维生素A的前体，是人体重要营养素，也能够影响蛋白质的合成和利用，促进体内软组织的生长发育。同时，β-胡萝卜素还有一定的防癌作用。因此，对β-胡萝卜素的研究倍受广注。

β-胡萝卜素分子中存在多个共轭双键结构，对许多物理、化学、生物等因素都不稳定，例如光辐射、高温、酸、碱、游离卤素、水分等，但氧是影响胡萝卜素稳定的主要因素。它不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱，溶于二硫化碳、苯、氯仿、己烷及植物油等，几乎不溶于甲醇和乙醇。

1 测定方法

1·1 天然β-胡萝卜素的提取

取切碎混匀的菜样30g，加入适量水(一般约l：0.5—2)，于捣碎机中捣碎，使匀浆呈稠糊状。

因β-胡萝卜素对弱碱比较稳定，所以选用氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂。稳定剂可以加快沉淀且使沉淀完全，从而减少β-胡萝卜素损失，提高提取率。

加入2%的CaCl2·2H2O其沉淀量最大，且β-胡萝卜素的含量最高。

因β-胡萝卜素是脂溶性物质，可以溶解在有机试剂中，根据相似相溶规律和β-胡萝卜素的理化性质，我们选用亲脂性较强的有机溶剂。

为避免β-胡萝卜素的不必要损失，在除去溶剂时应避免高温，故应优先选择低沸点的溶剂。

同时，根据β-胡萝卜素在不同溶剂中的溶解度；可以得出石油醚可以作为很好的β-胡萝卜素的溶剂。

因为蔬菜糊中含有大量的水分，直接选用石油醚很难从其中萃取β-胡萝卜素，选用水溶性的丙酮和石油醚的混合液萃取，这样丙酮会有效地使渣干燥因而在随后的萃取中，色素可以高效地进入萃取液，提高了萃取率。

故在萃取过程中，为了提高萃取率，应加入氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂，2%的CaCl2·2H2O作为沉淀剂；用石油醚和丙酮混合物作为提取剂。

1·2 测定

1·2·1 纸层析法

食品中的胡萝卜素可用生物学鉴定、溶剂分配和层析技术测定。50年代色层分析测定胡萝卜素已为世界广泛采用，中国医学科学院当时亦采用柱层析法。直至1975年，AOAC仍为柱层析法，但已不断改进。1952年Bauer曾提出类胡萝卜素的纸上层析法。

1·2·1·1 点样

准确吸取待检液0.1—0.2m l (随胡萝卜素含量而定)在滤纸下端基线上A B两点间和CD两点间迅速来回进行带状点样(见图1)，一次点完。

若按常规点状点样，需时约20分钟，且展开慢。故用改进的带状点样，只需10秒钟左右就能点完，展开速度比常规点样快，而且分离效果好。

1·2·1·2 展开

将滤纸卷成圆筒状，固定两边后放入事先用石油醚饱和的层析缸内，进行上行展开(见图2)。(注意:纸纹方向与展开方向一致；缸内石油醚深度约1cm即可。)

1·2·1·3 洗脱

取出滤纸自然挥发石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振荡，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。

1·2·2 薄层色谱法

薄层色谱法是在一定尺寸的表面平整的玻璃、铝板或塑料板上，把硅胶、纤维素、氧化铝、聚酰胺或化学键合硅胶等吸附剂铺成薄层(通常厚度为0.10～0.25mm)作为固定相，用展开剂(流动相)把被测样品展开，从而进行色谱分离和分析的方法。

1·2·2·1 制板

取30g硅胶G和70g的1%KOH溶液铺制2*5cm，0.25cm厚的

薄板，风干后在105℃下活化1h。

1·2·2·2 点样及展开

用微量定量点样管将β-胡萝卜素的样品溶液点于上述的薄层硅胶板上。

将点样后的薄层板置于石油醚-丙酮混合液(100：5)饱和的层析缸内，于暗处展开，展开时间为50min，因为β-胡萝卜素极易被氧化，展开时间超过一小时后，β-胡萝卜素会迅速变化。后观察黄色斑点位置并计算各斑点的Rf值。

1·2·3 分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围

内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

1·2·3·1 测定波长的选择

精密称取干燥至恒重的β-胡萝卜素对照品适量，用少量氯仿溶解后，再用环己烷配置成2.5μg/ml的溶液，在400~500nm波长之间扫描可见光吸收光谱，可得到最大吸收波长为455±1nm。因此选择测定波长为455nm。

β-胡萝卜素溶于氯仿，β-胡萝卜素对照品也极易溶于氯仿，所以选择氯仿为溶剂。

1·2·3·2 绘制标准曲线

精密称取干燥至恒重的β-胡萝卜素对照品约20mg，置100ml量瓶中，加少量氯仿溶解，用环己烷定容。精密量取10ml置100ml棕

色量瓶中，用环己烷定容，再精密量取4.0,5.0,6.0,7.0和8.0ml分别置50ml棕色量瓶中，用环己烷定容，以环己烷为空白，在455nm波长处测定吸收值。

过程中使用棕色的量瓶，因为β－胡萝卜素遇光、空气不稳定，水溶液更不稳定，所以整个实验中应避光操作，故配置在棕色的量瓶中。

1·2·3·3 样品的测定

取出适量的样品中的β-胡萝卜素，溶于氯仿中，并过滤，如此反复2~3次，后加入环己烷定容，在测定其吸光度，根据得到的吸光度值一定的计算得到样品中的β-胡萝卜素的含量。

1·2·4 高效液相色谱法

高效液相色谱又称为高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱，是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断地改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。

1·2·4·1 高效液相色谱法的分析原理

高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进

行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。