详细的淋巴细胞的分离、计数图文教程
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
详细的淋巴细胞的分离、计数图文教程
<交界液面：一定不要打乱 >
离心 〔200lt;1000rpm,5min> 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与 单核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
细胞计数
本实验：淋巴细胞
实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
数上不数下,数左不数右.
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度〔细胞数/ml>
= 2个大方格内细胞总数
×104×10 <稀释倍数
2
细胞活力检测：〔死细胞被染成蓝色,活细胞不着色
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
稀释的肝素抗凝血,沿管壁轻轻叠加于分离液上, 使两者形成一个清晰地界面.
细胞经离心分层后,缓慢小心吸取,切勿打破形成 的细胞层.
细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系统
自动细胞计数仪
知识回顾 Knowledge Review
T淋巴细胞的分离、计数
XX医学院免疫学教研室
淋巴细胞分离、E花环
注意事项
1、试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保 存不超过10天。 2、绵羊红细胞和淋巴细胞的比例以16:150:1为宜。 3、E花环计数前，应轻轻悬浮，不能用滴 管吹打，否则会使形成的花环脱落。
结果和讨论
• 记录实验结果，并绘制E花环阳性细胞图。
实验材料与试剂
①肝素（100U/毫升）、D-Hanks液、 淋巴细胞分离液（ficoll）、瑞氏 染液 ②离心机、显微镜、试管，吸管等。
实验方法与步骤
1、采集兔静脉血，注入盛有肝素（20U/ml）的 搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。 2、每组用吸管吸取2ml抗凝血，加入等体积即 2ml的室温D-Hanks液，使血液等倍稀释。 3、每组取已加入2ml淋巴细胞分离液的试管1支， 将离心管倾斜45角，在距分层液界面上1cm 处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面， 每管4ml，注意保持两者界面清晰，勿使血 液混入分层液内。
3、细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之 一，最适密度在室温下应为1.077±0.002；应 避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用；使用中应避免细菌污染。 4、离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过 低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多； 温度过高，增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞 活性。离心时最适温度为18-25℃。
淋巴细胞分离、E花环
微生物免疫教研室
实验目的
• 掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细 胞的的原理和方法。 • 掌握E花环测定原理和判定标准 • 熟悉E花环测定操作方法
实验原理
• 外周血淋巴细胞分离常用方法是聚蔗糖-泛影 葡胺密度梯度离心法。PBMC与血液中的其他成 分存在密度差异，利用密度在1.077±0.002之 间，而且近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液 （称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时， 各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血 浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的 上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于 分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位 于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。
分子医学实验：淋巴细胞分离、计数及E玫瑰花环实验
正常人的花环形成率50-70%，大致可 以代表周围血中T细胞的百分数。
临床应用
✓测定外周血中的T细胞数，观察受检者 的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。 ✓观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶 性肿瘤疗效的观察及预后判断等。
流式细胞术分离法
* 免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标 记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁 珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表 面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这 种表面标记的细胞分离出来。
磁珠 (microbead)
标记细胞上的磁珠在扫 描电镜下也几乎看不到
磁珠分离策略
一. 阳性分选 分离柱
2
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞百分率 = 活细胞数
细胞总数
×100%
方法评价
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
T淋巴细胞玫瑰花环
左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。
CD4+T细胞
磁珠标记目的细胞
CD4-T细胞
未标记细胞先行流出
移出磁场后收 集目的细胞
二. 阴性分选
磁珠标记非目的细胞
目的细胞先行流出
Thanks!
淋巴细胞和单核细胞（PBMC） 1.075-1.092
血小板
1.030-1.035
葡聚糖—泛影葡胺密度梯度离心法：
根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的 细胞呈梯度分布，从而分离出PBMC。
淋巴细胞分离的实验方法
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
报告实验二：淋巴细胞分离实验.ppt
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8
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
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9
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
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细胞计数
实验步骤 注意事项
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
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3
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
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实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
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12
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13
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
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16
c
4
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
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5
稀
释
外
周
淋巴细胞分离.
淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640粉末实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜操作流程：1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝3. 稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀）4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）5. 放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）6. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。
7. 重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数────────── × 10４×2(稀释倍数)411. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
注意事项:1. 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释3. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果4. 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面5. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：1. 准备计数板：2. 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3. 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4. 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数5. 计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数/毫升原=（4大格细胞数之和/4）×104注意事项：1. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液2. 加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3. 细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4. 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5. 镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数。
淋巴细胞分离实验
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
ห้องสมุดไป่ตู้
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
免疫学实验一
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
实验要求
华氏管中加入血样后，用记号笔作好 标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计 数板
试验报告要求
试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
《淋巴细胞分离》课件
1
Principles
FACS utilizes the fluorescence
Step 1: Cell Staining
2
emitted by fluorophores to identify and sort different types of cells.
Lymphocytes are stained with
Regular calibration of equipment, validation of assays, and adherence to standard operating procedures.
Future Directions and Emerging Trends
Cell Sorting Technology
Advancements in cell sorting technology enable higher throughput and improved precision.
Single-Cell Analysis
Investigating individual lymphocytes at the molecular level for personalized medicine and disease understanding.
《淋巴细胞分离》PPT课 件
本课件将介绍淋巴细胞分离的概述、在医学研究中的重要性以及分离方法。 通过丰富的内容和精美的图片，为大家呈现淋巴细胞分离的全貌。
Introduction
淋巴细胞分离是一项重要的技术，在医学研究中起着关键作用。本节将介绍淋巴细胞分离的定义、目的以及其 在疾病诊断和治疗中的应用。
4
fluorescence.
《淋巴细胞分离》课件
高回收率
该技术能够有效地回收大部分目标细胞，减少细胞的损失，提高实验 的效率和成功率。
无创伤性
淋巴细胞分离技术通常采用非侵入性的方法，对细胞无创伤，不会引 起细胞的死亡或活性下降。
可重复性好
加强不同领域之间的合作 与交流，共同推动淋巴细 胞分离技术的发展。
THANKS
THANK YOU FOR YOUR WATCHING
和准确性。
高效分离技术
研究新的分离方法，提高淋巴细胞 的纯度和回收率，降低对细胞的损 伤。
微流控技术应用
利用微流控芯片进行淋巴细胞分离 ，实现快速、高效的分离过程。
应用领域的拓展
临床诊断与治疗
再生医学与细胞治疗
淋巴细胞分离技术在免疫治疗、疾病 诊断等领域的应用将进一步拓展。
淋巴细胞分离技术的发展将促进再生 医学和细胞治疗领域的发展。
淋巴细胞分离技术的分类
根据分离原理，淋巴细胞分离技术可分为物理法、化学法和生物法等。
物理法包括离心法、过滤法和电泳法等；化学法包括溶解法、萃取法和 色谱法等；生物法则利用抗体与抗原的特异性结合进行分离。
根据应用目的，淋巴细胞分离技术可分为科研用和临床用两类。科研用 淋巴细胞分离技术主要用于实验室研究，而临床用淋巴细胞分离技术则 用于治疗疾病和免疫疗法等。
生物科学研究
淋巴细胞分离技术为免疫学、肿瘤学 、疫苗研发等领域的研究提供有力支 持。
未来发展方向与挑战
01
02
03
标准化与规范化
建立淋巴细胞分离技术的 标准操作规程，提高技术 的可重复性和可靠性。
淋巴细胞分离计数实验报告
淋巴细胞分离计数实验报告一、实验目的本实验旨在通过淋巴细胞分离计数实验，了解淋巴细胞的分离过程和计数方法，并掌握相关技能。
二、实验原理1. 淋巴细胞的分离：通过梯度离心法将淋巴细胞与其他血液成分进行分离。
2. 细胞计数：使用显微镜和特殊计数板对淋巴细胞进行计数。
三、实验材料和设备1. 血液样品2. Ficoll-Paque液（用于梯度离心）3. 生理盐水4. 无菌注射器、针头5. 显微镜、计数板四、实验步骤1. 取适量血液样品加入无菌注射器中。
2. 将Ficoll-Paque液加入另一无菌注射器中。
3. 在针头上滴上生理盐水，避免空气进入。
4. 缓慢注入Ficoll-Paque液至血液样品上方。
注意不要将两种液体混合。
5. 离心20分钟，速度为400g。
此时，白色细胞会沉积到Ficoll-Paque层，红细胞会沉积到底部。
6. 用无菌注射器吸取上层白色细胞，转移到新的离心管中。
7. 加入适量生理盐水，混合均匀。
8. 离心10分钟，速度为200g。
此时，淋巴细胞会沉积到底部。
9. 弃去上层液体，用生理盐水洗涤淋巴细胞。
10. 在计数板上吸取适量淋巴细胞进行计数。
五、实验结果分析1. 淋巴细胞的分离效果：根据显微镜下观察到的细胞形态和数量来判断分离效果是否良好。
2. 细胞计数：根据计数板上的规则进行计数，并结合显微镜下观察到的图像来确定结果。
六、实验注意事项1. 操作过程要严格无菌，避免污染样品。
2. 离心过程中要注意速度和时间，以避免对样品产生影响。
3. 计数板要保持干燥和清洁。
七、实验结论通过本次淋巴细胞分离计数实验，我们成功地将淋巴细胞与其他血液成分进行了分离，并通过计数板对淋巴细胞进行了计数。
这些实验结果为我们进一步了解淋巴细胞的生物学特性和相关疾病提供了基础数据。
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