基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
DNA定点突变实验
DNA定点突变实验标签：DNA 定点突变DNA定点突变可以：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
详细实验方法Dpn I法实验方法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)
得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术 （1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不 能互补的突变位点，而这两条引物有部 分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引 物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完 整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到 含有突变位点的DNA片段。
①首先人工合成一段含有特定突变位
点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，
该片段的其他部分可以与目的基因互补
配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的
基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生
而来）进行杂交；
M13噬菌体是一种丝状噬菌体， 内有一个环状单链DNA分子
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作
用下分别进行DNA链的合成和连接反应，
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基构因建，改有良的基质因粒组为质空粒白时质破粒坏，了将含上 述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培L养ac一Z基段因时(间因后)，，含再该将质菌粒液的涂大布肠在含 氨苄青霉素和__β__-_半__乳__糖__苷___的平板上。一段时间后杆，菌在不培能养分基解上β出-现半白乳色糖和苷蓝产色生两蓝种 菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是__色__物__质__（_。变），菌落为白色（果）
二轮微专题— 基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
• 【情境原理】 • 1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治
第七章 定点诱变
二、诱变寡核苷酸引物的设计
设计原则： 1. 与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错 误杂交 2. 足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的 引物要求至少25bp长 3. 错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模板 链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时，要 求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补 4. 5’端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA合成 不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的5’→3’外切核 酸酶活性是造成上游DNA合成取代5’核苷酸的原因
③ M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 ④ 与引入诱变的 Oligo 复性。
⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下， 以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链， 形成杂合双链。 ⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli MV1190 后，在 细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才 能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的 子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而 失去作为模板的能力。
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3பைடு நூலகம்DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。 Mg2+ ：独立作用于每条 DNA 链，位点随机。
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来选择用的
定点突变讲解学习
1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ）1. 两对引物的Tm 值都应相当。
两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
搭桥法定点突变3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
蛋白质定点突变原理及主要方法
蛋白质定点突变原理及主要方法嘿，朋友们！今天咱来聊聊蛋白质定点突变这档子事儿。
咱先说说这蛋白质定点突变是啥玩意儿。
你就把蛋白质想象成一个精巧的机器，每个零件都有它特定的位置和作用。
那定点突变呢，就好比咱要给这个机器的某个小零件来个小小的改造，让它能更好地工作或者有新的功能。
那怎么实现这个神奇的定点突变呢？这方法可不少嘞！比如说 PCR 介导的定点突变，这就像是个魔法棒，能在特定的地方变出我们想要的变化。
通过设计特定的引物，让 DNA 在复制的时候按照我们的想法来改变，是不是很厉害？还有基于寡核苷酸的定点突变，这就像是给蛋白质机器送上一个特别定制的小零件，替换掉原来的部分，让它焕然一新。
这就好像你有一辆自行车，你想让它速度更快，那你可能就会给它换个更轻的轮子或者调整一下链条的长度。
蛋白质定点突变也是这样，通过一些巧妙的方法来改变它的结构和功能。
再说说易错 PCR 吧，这就有点像抽奖，虽然有一定的随机性，但有时候也能给我们带来惊喜，产生一些意想不到的突变。
还有盒式突变，这就像给蛋白质机器换个大模块，直接来个大改变。
你说这多有意思啊！通过这些方法，科学家们就能像变魔术一样改变蛋白质的性质。
那能用来干啥呢？用处可大了去了！可以让药物更有效，可以让生物工程变得更厉害，可以帮助我们更好地理解生命的奥秘。
想象一下，如果我们能随心所欲地改变蛋白质的功能，那世界会变成什么样？是不是感觉很神奇？说不定未来我们就能通过蛋白质定点突变创造出各种神奇的东西，解决很多难题呢！总之，蛋白质定点突变原理和方法真的是非常有趣且重要的领域。
它就像一把钥匙，能打开无数未知的大门，让我们对生命和科学有更深入的了解和探索。
所以啊，大家可别小瞧了这看似小小的突变，它背后蕴含的可是大大的力量和无限的可能呢！。
蛋白质定点突变技术流程
蛋白质定点突变技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在开展蛋白质定点突变实验之前，需进行充分准备。
基因的定点诱变
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
基因定点突变技术.
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
在农业方面：
利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结 构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用 突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新 的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机 磷污染 民用杀虫剂。
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
PCR介导的定点突变的优势
1、突变体回收率高，有时不需要进行突变体筛选；
2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突
变； 3、可以在同一试管中完成所有反应； 4、快速简便，无需再噬菌体M13载体上进行分子克隆。
定点突变的原理和应用
定点突变的原理和应用1. 定点突变的定义定点突变是指在DNA序列中发生的局部突变，导致该位置的碱基序列发生改变。
这种突变只发生在特定的位点上，不会影响其他的DNA区域。
2. 定点突变的原理定点突变通常是通过基因编辑技术实现的，最常用的技术是CRISPR/Cas9系统。
以下是定点突变的原理步骤：•选择目标基因：首先需要选择一个或多个目标基因进行突变。
•设计RNA引导序列：设计一个RNA引导序列，使其能够与目标基因的特定区域配对。
•制备Cas9蛋白：将Cas9蛋白在实验室中通过重组技术制备出来。
•激活CRISPR/Cas9系统：给细胞提供Cas9蛋白和RNA引导序列，激活CRISPR/Cas9系统。
•RNA引导序列与目标基因配对：激活后的Cas9蛋白会与RNA引导序列形成复合物，引导该复合物与目标基因的特定区域配对。
•Cas9蛋白的剪切活性：一旦Cas9蛋白与目标基因配对成功，其剪切活性会被激活，导致目标基因的突变。
3. 定点突变的应用定点突变技术在生命科学研究和生物工程领域有广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用领域：3.1 疾病研究通过定点突变技术，可以模拟、研究多种遗传性疾病。
通过突变引入到实验动物模型中，可以深入了解疾病的发生机制、病理过程和潜在治疗方法。
3.2 基因治疗定点突变技术可以用于基因治疗，通过修复特定基因的突变来治疗某些遗传性疾病。
例如，修复CFTR基因的突变可以治疗囊性纤维化。
3.3 遗传改良定点突变技术可用于改良作物品种，使其具有更好的品质、更高的产量或更强的抗逆能力。
3.4 新药开发定点突变技术可以用于研究药物的作用机制和副作用，以及筛选潜在的药物靶点。
3.5 细胞工程通过定点突变技术，可以对细胞进行工程改造，从而使其具有特定的功能或性状，广泛应用于医药、能源和材料等领域。
4. 定点突变技术的优势和挑战定点突变技术相比传统的突变技术具有以下优势：•准确性：定点突变技术可以实现特定位点的精确突变，避免了无关的突变。
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
定点突变的原理及应用
定点突变的原理及应用1. 简介定点突变（Site-directed mutagenesis）是一种通过有意诱导改变DNA的特定位置的技术。
通过改变DNA序列，可以产生新的突变型，并用于研究基因功能、蛋白质结构与功能关系、以及药物设计等领域。
本文将介绍定点突变的原理及应用。
2. 原理定点突变技术主要有两种方法：化学法和分子生物学法。
以下是两种方法的原理说明：2.1 化学法化学法主要通过碱基修饰剂来改变DNA序列。
常用的方法是使用化学修饰剂N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) 或nitrous acid (HNO2)处理DNA，使其发生碱基突变。
这些碱基修饰剂会引起DNA中的碱基发生氧化、甲基化、烷基化等修饰，导致DNA序列的变化。
2.2 分子生物学法分子生物学法是目前应用较广泛的定点突变方法。
主要有以下几个步骤： 1）设计引物：根据目标突变位点的上下游序列，设计引物。
2）PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，得到含有突变位点的DNA片段。
3）点突变：使用特定的酶和突变体模板进行点突变反应，使目标位点发生突变。
4）验证突变：通过测序或其他技术手段验证突变是否成功。
3. 应用定点突变技术在许多领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：3.1 研究基因功能定点突变可以用于研究基因功能和调控机制。
通过引入特定的突变体，可以观察到基因功能的变化，进而研究基因在生物体内的作用机制。
3.2 蛋白质结构与功能关系研究蛋白质的结构与功能之间具有密切的关系。
定点突变可以通过改变蛋白质的氨基酸序列，研究蛋白质结构与功能之间的关系。
通过观察突变体的结构和功能变化，可以揭示蛋白质的结构与功能之间的关联。
3.3 药物设计与筛选定点突变技术在药物设计与筛选中也有重要应用。
通过针对特定的基因位点进行突变，可以筛选出与目标药物相互作用的突变体，从而为药物设计和筛选提供理论依据。
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
物合成率下降， 而且这些非全长 的序列需除去 以免影
响后续应用。最后 ， 在寡核苷酸的合成中也会出现大 量的错误 ， 而且出错误率随长度增加而增加。对于较 长的基因往往需要分成若干小的片段进行合成 ， 然后
— ●●———————一
进 行 Ｐ Ｃ Ｒ ｌ ｂ
第２ ９ 卷第 ８ 期
２ ０１ ３拄
中学生物学
Ｍｉ ｄ ｄ ｌ ｅ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖｏ １ ． ２ ９ Ｎｏ ． ８ ２ Ｏ ｌ ３
文件编 号 ： １ ０ ０ ３—７ ５ ８ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ８—０ ０ ０ ３—０ ２
以下 三种 。
盒式定点诱变是利用一段人工合成 的含有突变 序列的寡核苷酸片段 ，取代野生型基因中相应序列。 其中， 合成的 Ｄ Ｎ Ａ片段称为“ 盒” 。通常的做法是 ： 先
制备好含有正常 目的基因的重组质粒 ， 然后在 目的基 因需要突变 的部位附近找两个 限制酶位点 ， 利用合适 的 限制 酶将 二者 之 间 的 Ｄ Ｎ Ａ序列 切掉 ，而 由一 段人 工合成含有 突变碱基 的双链 Ｄ Ｎ Ａ片段通过 Ｄ Ｎ Ａ连
物时引入变异碱基 ， 便可使 Ｐ Ｃ Ｒ产物（ 目的基 因） 的
末端引入变异。 ② 变异部位位于基因的中间。 这种情 况需要借助重组 Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 可在 Ｄ Ｎ Ａ任意部位产生 定点诱变（ 图２ ） 。 首先在需要诱变的位置合成含有变
异碱基的互补引物（ 引物 ｂ 和ｃ ） ， 然后分别与 ３ 引物
１ ， ３ Ｐ Ｃ Ｒ介 导的 定点诱 变
－
碱基位 于中间的寡核苷酸 ， 一般长度约 １ ５ ～ ２ ０ ｂ ｐ 。这 条寡核苷酸链除了突变碱基外 ， 其余 的序列与野生型 Ｄ Ｎ Ａ分子中的相应序列完全一致。然后将合成的寡
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。
通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。
该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。
CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。
TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。
TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。
锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。
ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。
蛋白质工程改造分子的途径
蛋白质工程改造分子的途径蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的新兴技术领域，它能够按照人们的意愿对蛋白质分子进行有目的的改造，以满足不同的需求。
下面就来聊聊蛋白质工程改造分子的主要途径。
一、定点诱变技术定点诱变技术是蛋白质工程中常用的一种方法。
它就像是一个精准的“分子手术刀”，可以对编码蛋白质的基因进行特定位置的核苷酸替换、插入或缺失操作。
通过改变基因中的特定碱基序列，从而实现对蛋白质氨基酸序列的精确修改。
比如说，研究人员想要改变某个蛋白质的活性位点，就可以利用定点诱变技术，将编码该活性位点氨基酸的基因密码子进行替换，这样合成出来的蛋白质就可能具有新的活性或特性。
这种技术的优势在于能够精确控制蛋白质的结构和功能变化，就好像给蛋白质进行了一次“量身定制”的改造。
二、基因重组技术基因重组技术也是蛋白质工程改造分子的重要途径之一。
它就像是一个“分子拼图游戏”，把不同来源的基因片段进行重新组合。
研究人员可以从不同的生物体中获取具有特定功能的基因片段，然后将它们拼接在一起，构建出一个全新的基因。
当这个新基因表达时，就会产生具有多种功能的融合蛋白质。
例如，将具有催化功能的酶基因和具有特异性结合能力的抗体基因进行重组，就可以得到既具有催化活性又能特异性识别目标分子的融合蛋白，这种融合蛋白在生物医学领域有着广泛的应用前景，比如用于疾病的诊断和治疗。
三、分子定向进化分子定向进化就像是一场蛋白质的“自然选择”实验。
它是在体外模拟自然进化的过程，通过对蛋白质基因进行随机突变，然后在特定的筛选条件下，选择具有所需特性的突变体进行下一轮的进化。
在这个过程中，经过多轮的突变和筛选，蛋白质的结构和功能会逐渐朝着人们期望的方向优化。
比如说，要提高某种酶的催化效率，就可以通过分子定向进化技术，对编码该酶的基因进行随机突变，然后在含有底物的反应体系中筛选出催化效率更高的酶突变体，经过多次循环，就能够得到催化效率显著提高的酶。
四、计算机辅助设计随着计算机技术的飞速发展，计算机辅助设计也成为蛋白质工程改造分子的有力工具。