分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果-----------方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Baidu Nhomakorabea
550
环境科学学报
30 卷
腐熟时间是商品有机肥产生经济效益的关键（ 李少 明等，2008） . 由于烟杆中含有大量较难被生物降解 的木质纤维 素，因 此，木 质 纤 维 素 的 降 解 成 为 限 制 烟杆堆肥腐熟的主要因素. 研究发现，木质纤维素 主要在高温阶段被分解利用（ Finstein et al. ，1983； 王志超等，2006） . 由于温度的影响，高温阶段的微 生物种群受 到 很 大 的 抑 制，表 现 为 种 类 单 一、数 量 减少，比中温阶段的微生物种群要少 1 ～ 2 个数量 级，这无疑限制了木质纤维素物质的快速降解. 研 究表明，通 过 接 种 纤 维 素 降 解 菌 菌 剂，特 别 是 高 温 菌菌株，可 以 加 速 堆 体 升 温，加 快 堆 肥 底 物 中 木 质 纤维类物质的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期（ Xi et al. ，2005； Vargas-Garcia et al. ，2007； 黄 得 扬 等， 2004；徐智等，2005） . 在高温堆肥过程中，由于真菌 产生的胞外纤维素分解酶活性远远高于细菌产生 的纤维素分解酶活性（ 陈洪章等，2005） ，因此，本研 究通过筛选耐高温、高效的好氧纤维素降解真菌菌 株，考察其 对 烟 杆 的 降 解 效 果，以 便 开 发 能 够 利 用 废弃烟杆制作高温好氧堆肥的高效微生物菌剂.
分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果
张楠，刘东阳，杨兴明，徐阳春，沈其荣，黄启为*
南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095
收稿日期：2009-04-24
修回日期：2009-10-19
录用日期：2009-12-15
摘要：为研制促进烟杆堆肥的微生物菌剂，进行了分解纤维素的高温真菌筛选. 结果表明，从不同原料腐熟堆肥中筛选到 4 株降解纤维素的高 温真菌，它们均能在以羧甲基纤维素钠（ CMC-Na） 或烟杆粉末为唯一碳源的培养基上生长. 菌株在 2 ～ 5d 内可长满 CMC-Na-刚果红平板和烟杆 粉末培养基. 菌株摇瓶培养时 2d 可达到产酶高峰，酶活（ CMCase） 超过 10U. 菌株对烟杆的降解效果较好，7d 内的降解率最高可达 42. 2% ，对烟 杆中的纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别可达 52. 7% 、47. 9% 和 37. 6% . 关键词：纤维素降解真菌；降解；烟杆；纤维素；半纤维素；木质素
培养基：刚果红-羧甲基纤维素钠培养基（ 刚果 红-CMC 培养基） （ 张超等，2006） ；烟杆粉末培养基 （ T 培养基） 同刚果红-CMC 培养基，用烟杆烘干粉 碎后的粉末替代 CMC，倒平板前将烟杆粉末摇匀； 液体产酶培养基同 T 培养基，每升加 CaCl2 0. 1g，不 加琼脂. 以上培养基均在 121℃ 灭菌 20min. 2. 2 方法 2. 2. 1 高温纤维素降解真菌的筛选 称取样品 （ 牛粪、猪粪堆肥、腐殖土等） 10g 转移至盛有 90mL 无菌水的三角瓶中，170r·min － 1 摇床摇匀 30min，静 止后取 1mL 进行系列稀释，取稀释度为 1 × 10 － 2 ～ 1 × 10 － 4 的菌悬液 0. 1mL 分别涂布到刚果红-CMC 平 板和 T 平板上，置于 45℃ 高温培养箱中培养. 培养 2 ～ 3d 后，挑选在两种平板上生长较快并能在刚果 红-CMC 平板上产生透明圈的菌落，再接种到 T 平
板上，选取生长速度快的菌株，并连续纯化 3 次获得 纯培养. 2. 2. 2 菌株生长速度的测定 对上述纯化后的菌 株和 Z-5 进行生长速度测定，将生长至直径 4cm 左 右的菌落用打孔器打洞，将菌饼（ 直径为 0. 90cm） 分别移至不含刚果红的 CMC 平板与 T 平板中央， 45℃ 恒 温 培 养，每 24h 定 期 测 量 菌 落 直 径，共 测 5 次. 2. 2. 3 菌种的初步鉴定 根据形态学观察，对菌株 进行初步鉴定. 2. 2. 4 羧甲基纤维素酶（ CMCase） 酶活测定 采用 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 （ DNS） （ 张丽青等， 2007） 测定酶解液中还原糖含量. 定义在实验反应 条件下，每 1mL 酶液 30min 内催化 CMC-Na 水解生 成 1mg 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位 U. 2. 2. 5 菌株对烟杆的降解效果 采用三角瓶固体 发酵的方法研究各菌株对烟草秸秆的降解效果. 每 个 150mL 三角瓶分装烘干的、剪碎至 1cm 宽、2 ～ 3cm 长 的 烟 杆 5g、（ NH4 ） 2 SO4 0. 2g、MgSO4·7H2 O 0. 05g，每瓶加 5mmol·L － 1 pH = 7. 0 的磷酸缓冲液 （ PBS）15mL. 各瓶分别接种各菌株 0. 25mL 1 × 106 cfu·mL －1 的孢子悬液，混匀后置于 45℃ 恒温培养，定 期观察烟杆的形态变化，7d 后测定其降解率（ η）. 用 蒸馏水 轻 轻 洗 除 去 菌 体 和 孢 子 等，将 固 形 物 置 于 60℃ 烘箱中烘至恒重，用电子天平分别称量未被降解 的烟叶脉质量记为 W1 （ g），发酵前的叶脉质量记为 W0 （g），则降解率 η = （W0 － W1 ） / W0 × 100% . 2. 2. 6 烟杆纤维素、半纤维素和木质素含量测定 参照熊素敏等（2005） 的方法，在固体发酵前后测定 各处理烟杆的纤维素、半纤维素和木质素含量. 2. 3 数据分析
accepted 15 December 2009
Abstract： Thermophilic cellulose-decomposing fungi were screened to develop microbial inoculums which could promote the composting of tobacco stems. Four strains of thermophilic cellulose-decomposing fungi were isolated from composts of different substrates，and they could use carboxymethyl cellulose Na （ CMC-Na） or tobacco stem powder as sole carbon source. The strains could overgrow in CMC Na-Congo red medium and tobacco stem powder medium within 2 ～ 5 days. In liquid medium，the strains produced the highest CMCase activity after 2 days inoculation，which reached 10U. They could decompose tobacco stems，cellulose，hemicellulose and lignin in the tobacco stems by 42. 2% ，52. 7% ，47. 9% and 37. 6% ，respectively，within 7 days. Keywords： cellulose-decomposing fungi；decompose；tobacco stems； cellulose； hemicellulose； lignin
第 30 卷第 3 期 2010 年 3 月
环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae
Vol. 30，No. 3 Mar. ，2010
张楠，刘东阳，杨兴明，等. 2010. 分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果［J］. 环境科学学报，30（3） ：549 － 555 Zhang N，Liu D Y，Yang X M，et al. 2010. Screening of thermophilic cellulose-decomposing fungi and their efficiency in decomposing tobacco stems［J］. Acta Scientiae Circumstantiae，30（3） ：549 － 555
高温堆肥是目前有机废弃物无害化处理和资
源化利用最安全有效的途径之一. 利用微生物降解 可以将废弃烟杆制成优良的有机堆肥，使之变废为 宝（ 高超等，2000；沈其荣等，1996 ） . 由于烟杆中烟 碱含量较高，使堆腐后的有机肥具有一定的抗病和 生防作用，同时，也可以作为植物生长的调节剂，具 有减 少 肥 料 中 铵 态 氮 流 失 的 作 用 （ 姚 玉 霞 等， 1995） . 因此，利 用 微 生 物 降 解 废 弃 烟 杆 来 制 作 堆 肥，对于充 分 利 用 废 弃 烟 杆 资 源，减 少 植 烟 区 域 环 境污染具有重要的意义.
文章编号：0253-2468（2010）03-549-07
中图分类号：X705
文献标识码：A
Screening of thermophilic cellulose-decomposing fungi and their efficiency in decomposing tobacco stems
ZHANG Nan，LIU Dongyang，YANG Xingming，XU Yangchun，SHEN Qirong，HUANG Qiwei*
College of Resources and Environment Sciences，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095
Received 24 April 2009；
received in revised form 19 October 2009；
在高温堆 肥 过 程 中，加 快 升 温 速 度、缩 短 堆 肥
基金项目： 农业部农业公益性行业科研专项（ No. 200803031） ；农业部 948 项目（ No. 2006-G62） Supported by the Public Sector Projects of the Ministry of Agriculture of China（ No. 200803031 ） and the Weighty International Collaborative Research Projects of the Ministry of Agriculture of China（ No. 2006-G62） 作者简介： 张楠（1986—） ，男，E-mail：zhangnan_19860227@ sina. com； * 通讯作者（ 责任作者） ，E-mail：qwhuang@ njau. edu. cn Biography： ZHANG Nan（1986—） ，male，E-mail：zhangnan_19860227@ sina. com； * Corresponding author，E-mail：qwhuang@ njau. edu. cn
1 引言（ Introduction）
我国是世界上烟草栽培面积最大的国家，每年 烟叶 产 量 约 为 450 × 104 ～ 500 × 104 t （ 李 少 明 等， 2008） ，与此同时产生了大量的废弃烟杆. 由于烟杆 不易腐烂也不能直接用于肥田，因而绝大部分都是 作为废弃物被丢弃或焚烧，这不仅不同程度地污染 了当地的生活生产环境，也造成了资源的浪费. 因 此，如何开发利用烟杆，发挥其潜在资源价值，成为 烟草生产基地当前需要解决的问题.
2 材料与方法（ Materials and methods）
2. 1 材料 样品：牛粪堆肥由江苏省江阴市联业生物科技
有限公司生产，猪粪堆肥由江苏田娘农业科技（ 集 团） 有 限 公 司 生 产，腐 殖 土 取 自 安 徽 宣 城 烟 草 种 植区.
菌种：为本实验室从中药渣堆肥中筛选的纤维 素高温降解真菌菌株———灰绿曲霉 Z-5.
550
环境科学学报
30 卷
腐熟时间是商品有机肥产生经济效益的关键（ 李少 明等，2008） . 由于烟杆中含有大量较难被生物降解 的木质纤维 素，因 此，木 质 纤 维 素 的 降 解 成 为 限 制 烟杆堆肥腐熟的主要因素. 研究发现，木质纤维素 主要在高温阶段被分解利用（ Finstein et al. ，1983； 王志超等，2006） . 由于温度的影响，高温阶段的微 生物种群受 到 很 大 的 抑 制，表 现 为 种 类 单 一、数 量 减少，比中温阶段的微生物种群要少 1 ～ 2 个数量 级，这无疑限制了木质纤维素物质的快速降解. 研 究表明，通 过 接 种 纤 维 素 降 解 菌 菌 剂，特 别 是 高 温 菌菌株，可 以 加 速 堆 体 升 温，加 快 堆 肥 底 物 中 木 质 纤维类物质的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期（ Xi et al. ，2005； Vargas-Garcia et al. ，2007； 黄 得 扬 等， 2004；徐智等，2005） . 在高温堆肥过程中，由于真菌 产生的胞外纤维素分解酶活性远远高于细菌产生 的纤维素分解酶活性（ 陈洪章等，2005） ，因此，本研 究通过筛选耐高温、高效的好氧纤维素降解真菌菌 株，考察其 对 烟 杆 的 降 解 效 果，以 便 开 发 能 够 利 用 废弃烟杆制作高温好氧堆肥的高效微生物菌剂.
分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果
张楠，刘东阳，杨兴明，徐阳春，沈其荣，黄启为*
南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095
收稿日期：2009-04-24
修回日期：2009-10-19
录用日期：2009-12-15
摘要：为研制促进烟杆堆肥的微生物菌剂，进行了分解纤维素的高温真菌筛选. 结果表明，从不同原料腐熟堆肥中筛选到 4 株降解纤维素的高 温真菌，它们均能在以羧甲基纤维素钠（ CMC-Na） 或烟杆粉末为唯一碳源的培养基上生长. 菌株在 2 ～ 5d 内可长满 CMC-Na-刚果红平板和烟杆 粉末培养基. 菌株摇瓶培养时 2d 可达到产酶高峰，酶活（ CMCase） 超过 10U. 菌株对烟杆的降解效果较好，7d 内的降解率最高可达 42. 2% ，对烟 杆中的纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别可达 52. 7% 、47. 9% 和 37. 6% . 关键词：纤维素降解真菌；降解；烟杆；纤维素；半纤维素；木质素
培养基：刚果红-羧甲基纤维素钠培养基（ 刚果 红-CMC 培养基） （ 张超等，2006） ；烟杆粉末培养基 （ T 培养基） 同刚果红-CMC 培养基，用烟杆烘干粉 碎后的粉末替代 CMC，倒平板前将烟杆粉末摇匀； 液体产酶培养基同 T 培养基，每升加 CaCl2 0. 1g，不 加琼脂. 以上培养基均在 121℃ 灭菌 20min. 2. 2 方法 2. 2. 1 高温纤维素降解真菌的筛选 称取样品 （ 牛粪、猪粪堆肥、腐殖土等） 10g 转移至盛有 90mL 无菌水的三角瓶中，170r·min － 1 摇床摇匀 30min，静 止后取 1mL 进行系列稀释，取稀释度为 1 × 10 － 2 ～ 1 × 10 － 4 的菌悬液 0. 1mL 分别涂布到刚果红-CMC 平 板和 T 平板上，置于 45℃ 高温培养箱中培养. 培养 2 ～ 3d 后，挑选在两种平板上生长较快并能在刚果 红-CMC 平板上产生透明圈的菌落，再接种到 T 平
板上，选取生长速度快的菌株，并连续纯化 3 次获得 纯培养. 2. 2. 2 菌株生长速度的测定 对上述纯化后的菌 株和 Z-5 进行生长速度测定，将生长至直径 4cm 左 右的菌落用打孔器打洞，将菌饼（ 直径为 0. 90cm） 分别移至不含刚果红的 CMC 平板与 T 平板中央， 45℃ 恒 温 培 养，每 24h 定 期 测 量 菌 落 直 径，共 测 5 次. 2. 2. 3 菌种的初步鉴定 根据形态学观察，对菌株 进行初步鉴定. 2. 2. 4 羧甲基纤维素酶（ CMCase） 酶活测定 采用 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 （ DNS） （ 张丽青等， 2007） 测定酶解液中还原糖含量. 定义在实验反应 条件下，每 1mL 酶液 30min 内催化 CMC-Na 水解生 成 1mg 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位 U. 2. 2. 5 菌株对烟杆的降解效果 采用三角瓶固体 发酵的方法研究各菌株对烟草秸秆的降解效果. 每 个 150mL 三角瓶分装烘干的、剪碎至 1cm 宽、2 ～ 3cm 长 的 烟 杆 5g、（ NH4 ） 2 SO4 0. 2g、MgSO4·7H2 O 0. 05g，每瓶加 5mmol·L － 1 pH = 7. 0 的磷酸缓冲液 （ PBS）15mL. 各瓶分别接种各菌株 0. 25mL 1 × 106 cfu·mL －1 的孢子悬液，混匀后置于 45℃ 恒温培养，定 期观察烟杆的形态变化，7d 后测定其降解率（ η）. 用 蒸馏水 轻 轻 洗 除 去 菌 体 和 孢 子 等，将 固 形 物 置 于 60℃ 烘箱中烘至恒重，用电子天平分别称量未被降解 的烟叶脉质量记为 W1 （ g），发酵前的叶脉质量记为 W0 （g），则降解率 η = （W0 － W1 ） / W0 × 100% . 2. 2. 6 烟杆纤维素、半纤维素和木质素含量测定 参照熊素敏等（2005） 的方法，在固体发酵前后测定 各处理烟杆的纤维素、半纤维素和木质素含量. 2. 3 数据分析
accepted 15 December 2009
Abstract： Thermophilic cellulose-decomposing fungi were screened to develop microbial inoculums which could promote the composting of tobacco stems. Four strains of thermophilic cellulose-decomposing fungi were isolated from composts of different substrates，and they could use carboxymethyl cellulose Na （ CMC-Na） or tobacco stem powder as sole carbon source. The strains could overgrow in CMC Na-Congo red medium and tobacco stem powder medium within 2 ～ 5 days. In liquid medium，the strains produced the highest CMCase activity after 2 days inoculation，which reached 10U. They could decompose tobacco stems，cellulose，hemicellulose and lignin in the tobacco stems by 42. 2% ，52. 7% ，47. 9% and 37. 6% ，respectively，within 7 days. Keywords： cellulose-decomposing fungi；decompose；tobacco stems； cellulose； hemicellulose； lignin
第 30 卷第 3 期 2010 年 3 月
环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae
Vol. 30，No. 3 Mar. ，2010
张楠，刘东阳，杨兴明，等. 2010. 分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果［J］. 环境科学学报，30（3） ：549 － 555 Zhang N，Liu D Y，Yang X M，et al. 2010. Screening of thermophilic cellulose-decomposing fungi and their efficiency in decomposing tobacco stems［J］. Acta Scientiae Circumstantiae，30（3） ：549 － 555
高温堆肥是目前有机废弃物无害化处理和资
源化利用最安全有效的途径之一. 利用微生物降解 可以将废弃烟杆制成优良的有机堆肥，使之变废为 宝（ 高超等，2000；沈其荣等，1996 ） . 由于烟杆中烟 碱含量较高，使堆腐后的有机肥具有一定的抗病和 生防作用，同时，也可以作为植物生长的调节剂，具 有减 少 肥 料 中 铵 态 氮 流 失 的 作 用 （ 姚 玉 霞 等， 1995） . 因此，利 用 微 生 物 降 解 废 弃 烟 杆 来 制 作 堆 肥，对于充 分 利 用 废 弃 烟 杆 资 源，减 少 植 烟 区 域 环 境污染具有重要的意义.
文章编号：0253-2468（2010）03-549-07
中图分类号：X705
文献标识码：A
Screening of thermophilic cellulose-decomposing fungi and their efficiency in decomposing tobacco stems
ZHANG Nan，LIU Dongyang，YANG Xingming，XU Yangchun，SHEN Qirong，HUANG Qiwei*
College of Resources and Environment Sciences，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095
Received 24 April 2009；
received in revised form 19 October 2009；
在高温堆 肥 过 程 中，加 快 升 温 速 度、缩 短 堆 肥
基金项目： 农业部农业公益性行业科研专项（ No. 200803031） ；农业部 948 项目（ No. 2006-G62） Supported by the Public Sector Projects of the Ministry of Agriculture of China（ No. 200803031 ） and the Weighty International Collaborative Research Projects of the Ministry of Agriculture of China（ No. 2006-G62） 作者简介： 张楠（1986—） ，男，E-mail：zhangnan_19860227@ sina. com； * 通讯作者（ 责任作者） ，E-mail：qwhuang@ njau. edu. cn Biography： ZHANG Nan（1986—） ，male，E-mail：zhangnan_19860227@ sina. com； * Corresponding author，E-mail：qwhuang@ njau. edu. cn
1 引言（ Introduction）
我国是世界上烟草栽培面积最大的国家，每年 烟叶 产 量 约 为 450 × 104 ～ 500 × 104 t （ 李 少 明 等， 2008） ，与此同时产生了大量的废弃烟杆. 由于烟杆 不易腐烂也不能直接用于肥田，因而绝大部分都是 作为废弃物被丢弃或焚烧，这不仅不同程度地污染 了当地的生活生产环境，也造成了资源的浪费. 因 此，如何开发利用烟杆，发挥其潜在资源价值，成为 烟草生产基地当前需要解决的问题.
2 材料与方法（ Materials and methods）
2. 1 材料 样品：牛粪堆肥由江苏省江阴市联业生物科技
有限公司生产，猪粪堆肥由江苏田娘农业科技（ 集 团） 有 限 公 司 生 产，腐 殖 土 取 自 安 徽 宣 城 烟 草 种 植区.
菌种：为本实验室从中药渣堆肥中筛选的纤维 素高温降解真菌菌株———灰绿曲霉 Z-5.