第7章色谱分离技术
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第七章 色谱分离技术
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
色谱分离技术—吸附色谱分离技术
4.2 吸附色谱分离技术
4.色谱分离技术
吸附色谱分离技术
1
基本原理
2
吸附剂与展开剂
3
影响吸附分离的因素
4
薄层色谱分离技术
5
柱色谱分离技术
6
吸附色谱分离技术在生产中的应用
基本原理
利用各组分与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、 定向力以及氢键)的差异而实现分离。
基本原理
平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数）
柱色谱分离技术
3.上样
➢湿法上样：把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂 上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂 上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。 ➢干法上样：可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将 其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉 末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。
柱色谱分离技术
4.洗脱
➢恒定洗脱法 ➢逐次洗脱法 ➢梯度洗脱法
吸附色谱分离技术的应用
吸附色谱法主要用于具有不同官能团或具有相同官能团但数目不同的极性 化合物及异构体等生物小分子物质的分离分析。
成分鉴别 分离纯化
吸附色谱分离技术的应用
硅胶吸附色谱 应用比较广泛，多用于中药成分的分析检测。
例：牛黄解毒片的鉴别
1cm≤点间距≤1.5cm
薄层色谱分离技术
3.展开
➢展开剂要接触到吸附剂下沿， 但切勿接触到样点。 ➢盖上盖子，展开。 ➢观察展开情况。 ➢取出薄层板
展开示意图
薄层色谱分离技术 3.展开
上升法
倾斜上行法
下降法
薄层色谱分离技术
4.色谱分离技术
吸附色谱分离技术
1
基本原理
2
吸附剂与展开剂
3
影响吸附分离的因素
4
薄层色谱分离技术
5
柱色谱分离技术
6
吸附色谱分离技术在生产中的应用
基本原理
利用各组分与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、 定向力以及氢键)的差异而实现分离。
基本原理
平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数）
柱色谱分离技术
3.上样
➢湿法上样：把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂 上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂 上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。 ➢干法上样：可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将 其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉 末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。
柱色谱分离技术
4.洗脱
➢恒定洗脱法 ➢逐次洗脱法 ➢梯度洗脱法
吸附色谱分离技术的应用
吸附色谱法主要用于具有不同官能团或具有相同官能团但数目不同的极性 化合物及异构体等生物小分子物质的分离分析。
成分鉴别 分离纯化
吸附色谱分离技术的应用
硅胶吸附色谱 应用比较广泛，多用于中药成分的分析检测。
例：牛黄解毒片的鉴别
1cm≤点间距≤1.5cm
薄层色谱分离技术
3.展开
➢展开剂要接触到吸附剂下沿， 但切勿接触到样点。 ➢盖上盖子，展开。 ➢观察展开情况。 ➢取出薄层板
展开示意图
薄层色谱分离技术 3.展开
上升法
倾斜上行法
下降法
薄层色谱分离技术
第7章 色谱分离技术
(4) 酚-醛型树脂 主要由水杨酸、苯酚和甲醛 缩聚而成，水杨酸和甲醛形成线状结构，苯酚作 为交联剂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
现代分离方法与技术第7章 制备色谱技术
第7章 制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术 7.2 常规柱色谱技术 7.3 加压液相色谱技术 7.4 逆流色谱法 7.5 超临界流体色谱法 7.6 模拟床移动色谱法 7.7 制备气相色谱法 7.8 径相色谱法 7.9 顶替色谱法 7.10 离子交换与吸附
制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50 mg足够，分析用标准
品100 mg以上，有机合成通常需要g级以
上；
薄层色谱
柱色谱
制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术
设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及 分辨率高； a. 切割谱带更加方便； b. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、 薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联 用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
50-300
2-7
50-500
2-12
制备色谱技术
7.2 常规柱色谱技术
可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，
因此样品量可以更大；
分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；
不适合小颗粒的吸附剂？
改进方法：减压、加压等
制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
比表面积
制备色谱技术
大孔吸附树脂使用：
用前需预处理除去杂质：
回流法、水蒸气蒸馏法；
渗漉法----乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12
h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱2-3倍柱体
积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳 浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采 用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐 酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。
7.1 制备薄层色谱技术 7.2 常规柱色谱技术 7.3 加压液相色谱技术 7.4 逆流色谱法 7.5 超临界流体色谱法 7.6 模拟床移动色谱法 7.7 制备气相色谱法 7.8 径相色谱法 7.9 顶替色谱法 7.10 离子交换与吸附
制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50 mg足够，分析用标准
品100 mg以上，有机合成通常需要g级以
上；
薄层色谱
柱色谱
制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术
设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及 分辨率高； a. 切割谱带更加方便； b. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、 薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联 用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
50-300
2-7
50-500
2-12
制备色谱技术
7.2 常规柱色谱技术
可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，
因此样品量可以更大；
分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；
不适合小颗粒的吸附剂？
改进方法：减压、加压等
制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
比表面积
制备色谱技术
大孔吸附树脂使用：
用前需预处理除去杂质：
回流法、水蒸气蒸馏法；
渗漉法----乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12
h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱2-3倍柱体
积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳 浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采 用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐 酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。
生物分离与纯化技术(生化工艺)第7章 色谱分离技术
2013-9-13
第3节
离子交换色谱
二、离子交换色谱原理 离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，洗脱 液为流动相的色谱分离操作，由于不同物质电 荷性质、数量、强弱等不同，因而与离子交换 剂的固定电荷静电吸引力不同，使得其在固定 相、流动相分配不同，因此迁移速率不同而实 现对混合物的分离。
2013-9-13
任何色谱分离过程实 质上都是溶质随流动 相流动而迁移的过程 ，不同溶质在流动相 和固定相中的分配比 例不同，因而随流动 相迁移的速度不同， 从而使不同物质分离 开来。
2013-9-13
洗脱曲线
2013-9-13
5
• 色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平
衡时的一段柱高（塔板高度）
• 反映不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 柱高之间的关系 • 理论塔板数的计算方法：
[ — R A - ] [ B- ] Kp [ — R B- ] [ A - ]
2013-9-13
不同离子交换反应平衡常数不同，因 而荷点溶质分配在离子交换剂与水溶 液中的比例不同
第3节
离子交换色谱
一、离子交换概述 影响离子交换选择性的因素
（1） 离子电荷数（化合价） （2） 离子水合半径 （3） 离子电荷强弱
2013-9-13
第3节
离子交换色谱
一、离子交换概述 离子交换过程的本质及选择性
离子交换是离子交换剂上的反离子电离至水溶液中而溶液中其 他与固定电荷带有相反电荷的离子通过静电吸引力而被吸附在 固定电荷，其本质上是一个可逆化学反应（平衡反应）。
— R B－ A－ —R A－ B－
第7章 色谱分离技术
第1节 色谱技术基础 第2节 吸附色谱 第3节 离子交换色谱 第4节 凝胶色谱
07第七章色谱法分离原理
<一> 分离度Rs： 定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与该两
组分色谱峰基线宽度平均值之比。
定义式： RS1 2 tRY 22tY R1 1 2tY R2 2 Y t1 R1
RS
2t'R2 t'R1 Y2 Y1
① 当Rs＜1时，两色谱峰总是有部分重叠；
保留体积VR：在保留时间内通过色谱柱的流动相 体积。即将组分从柱中带出所需的 流动相体积。 VR=tR×F0
调整保留体积 V R'： 某组分的保留体积扣除死体 积后的剩余体积，称为该组
分的调整保留体积。
=VVRR' -VM
相对保留值 r21： 某组分2与组分1的调整保
留值之比。
r21
t'R t'R
③ 在溶质浓度低时，Cs 基本上正比于Cm，曲 线近似直线。
2.线性洗脱色谱： ●在色谱中，分配系数K为常数时所进行的色谱
过程，即称为 线性洗脱色谱。 结论：CS值大，则K值大，溶质进入固定相的
量就多。 推论：溶质流过色谱柱时，分配系数K值大的组
分通过色谱柱所需时间长，而K值小的组 分通过色谱柱所需时间短。当样品中各 组分在两相的分配系数K不同时，就能实 现差速迁移，达到分离的目的。
色谱柱分离理混论塔板数
合组分的能力
色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加， 随板高H的增大而减小。
3．塔板理论对色谱的解释：
第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数 n
第二大，即于当在5样0t时R品一，进定可入时得色，到谱若基柱色本后谱对，称只的要峰各形组曲分线在；两相 间峰的越分窄配，系则数n有值微越小大差，异，经过反复多次 的H分越配小平，衡柱后效，能仍越可高获。得良好的分离；
色谱分离的技术
是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。 若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分 子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳 定的化合物，都可用色谱法分离。 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径 选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
第七章 色谱分析基础
3.分配比k
分配比又称容量因子、容量比，它是指在一 定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时， 分配在固定相和流动相中的质量比。即 ：
组分在固定相中的质量 ms k 组分在流动相中的质量 mM
k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于 柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量 色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。
三、 速率理论—影响柱效的因素
1. 速率方程（也称范.弟姆特方程式）
H = A + B/u + C· u
H：理论塔板高度，
u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？
t R ( B) k ( B) K ( B) t R ( A) k ( A) K ( A)
上式表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分 配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。 如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重 合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因 此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。
7.2 色谱流出曲线及有关术语
一、流出曲线和色谱峰
二、基线
柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即 图18－3中O—t线．稳定的基线应该是一条水平直线。
三、峰高
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图B′A
四、保留值
1．死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱 柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间 称为死时间，如图O′A′。
体），称为流动相。
二、色谱法分类
1．按两相状态分类
(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
色谱分离技术
五、色谱图及基本概念
色谱图： 色谱图：混合液中各种 组分经色谱柱随流动相 依次流出，在检测器上 依次流出， 检测到的信号随时间的 变化曲线或随流动相的 体积的变化曲线为色谱 图。
1. 基线 色谱柱出口没有组分流出， 色谱柱出口没有组分流出，仅有纯流动相流 过监测器，即无试样通过检测器时， 过监测器，即无试样通过检测器时，检 测到的信号即为基线。 测到的信号即为基线。稳定的基线应是 一条平行于横坐标的直线。 一条平行于横坐标的直线。
分离度R的物理意义 分离度 的物理意义 分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽 分离度 综合考虑了保留值的差值与峰宽 两方面的因素对柱效率的影响， 两方面的因素对柱效率的影响，可衡量色 谱柱的总分离效能，R值越大 值越大， 谱柱的总分离效能，R值越大，两色谱峰 的距离越远，分离效果越好。 的距离越远，分离效果越好。
噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 如空气峰。 如空气峰。
2、色谱峰 当样品中的组分随流动相流入检测器时，检 当样品中的组分随流动相流入检测器时， 测器的相应信号大小随时间变化所形成的 峰形曲线称为色谱峰， 峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的 连接直线称为峰底。 连接直线称为峰底。
色谱技术(分配色谱)--概念 色谱技术(分配色谱)--概念： 概念：
色谱技术是一组相关分离方法的总称， 色谱技术是一组相关分离方法的总称，色 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 和流动相，根据物质在两相间的分配行为 和流动相， 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 ）， 吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 （吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 的目的。 的目的。
气相色谱法
B、固定液的分离特征
被测组分在固定液中溶解度或分配系数的大小与 被测组分和固定液两种分子之间相互作用力的大小有 关。分子间作用力 ①静电力（定向力） ②诱导力 ③色散力 ④氢键例 （不同固定液的分离性质用麦氏常数表征——表2-6麦 氏常数 ）
C、固定液的选择
固定液选择——相似相溶原理
选择固定液的基本原则： ①分离非极性物质 选用非极性固定液——鲨鱼烷、甲基硅油、阿批松。 被分离组分和固定液之间的作用力是色散力。各组分按 沸点顺序先后流出色谱柱。沸点低的组分先流出，沸点 高的组分后流出。如果被分离组分是同系物，由于色散 力与分子量成正比，各组分按碳顺序分离。
n 有效 5 .54 ( H 有效 L n 有效
' Βιβλιοθήκη RY1 / 2) 16 (
2
' tR
Y
)2
( 2 18 ) ( 2 19 )
有效塔板数和有效塔板高度较为真实的反应了柱效能的好坏。 成功处：解释流出曲线的形状（呈正态分布）、浓度极大点的位 置以及计算评价柱效能等方面。 不足处：基本假设是不当 。
O
Fe
O
有吸附性，担体需加以钝化处理。处理方法：酸洗， 碱洗，硅熔 。
2、固定液
A、对固定液的要求
①挥发性小 ②热稳定性好 操作温度下有较低蒸气压，以免流失； 操作温度下不发生分解；
③对试样各组分有适当的溶解能力。 ④具有高的选择性 对沸点相同或相近的不同物质有 尽可能高的溶解能力； ⑤化学稳定性好 不与被测物质起化学反应。
Dg—组分在气相中的扩散系数（单位为cm2·-1） s
纵向扩散与组分在柱内的保留时间有关，保留时 间越长，分子扩散项对色谱峰扩张的影响就越显著。 相对分子质量较大的载气（如氨气）可使B项降低。 Dg随柱温增高而增加，但反比与柱压。 弯曲因子r：空心毛细管柱r＝1、填充柱中扩散程 度降低r<1、硅藻土担体r＝0.5～0.7
生物分离工程 第七章 色谱技术-亲和色谱
常见亲合作用体系
特异性 高特异性
亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
（7）组氨酸 在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有 弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质 发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十 分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋 白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有 可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋 白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用 最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利 用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质， 洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋 白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较 广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。
（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间 具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～ 1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单 抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物 大分子的有效手段。
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
仪器分析第7章
两种色谱动力学理论：塔板理论和速率理论；
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
2. 有效塔板数和有效塔板高度
组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和 有效塔板高度：
3.塔板理论的特点和不足
(1) 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小) ，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高。
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散, 导致色谱峰变宽，H↑(n↓)， 分离变差. (2)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑; (3) 扩散系数与温度有关。 (4) 扩散系数：Dg ∝(M载气)-1/2 ； M载气↑，B值↓。
C ·u —传质阻力项
C =（Cg + CL）
2 0.01k 2 d p Cg 2 (1 k ) Dg
谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择 性。若相对保留值等于1，则不能分离。
VR KVs
VR V M 1 k , t R t M 1 k
7.3 色谱流出曲线的意义： 色谱峰数 = 样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价 指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的 依据。
分的分配系数K越大，出峰越慢；试样中的各组分具有不 同的K值是分离的基础； 试样一定时，K主要取决于固定相性质；选择适宜的固定 相可改善分离效果。
分配系数是色谱分离的依据。
3. 保留因子与分配系数的关系
二、色谱流出曲线与术语
1.基线
无试样通过检测器时， 检测到的信号即为基线。
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注意：
整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的 溶液流干。
应控制洗脱液的流速。 应尽量在短时间内完成一个柱层析的分离。
洗脱操作的方式可分为：
前沿分析法（迎头法）：将混合物溶液连续通
过色谱柱，只有吸附力量最弱的组分最先自柱中 流出，其他各组分不能达到分离。
洗脱展开法（洗脱分析法）：先将混合物尽量
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一
相（一般是气体或液体）称为流动相 。
三、色谱分离技术的分类 根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的 规模可分为色谱分析规模(小于10mg)、
半制备(10~50mg)、制备规模
氧化铝、非极性炭及特殊作用的分子筛等。
1.基本原理
吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子 吸附力的差异而分离的方法。吸附力主 要是范德华力，有时也可能形成氢键或
化学键。吸附法的关键是选择吸附剂和
展开剂。
吸附色谱分离过程示意图
举例：
下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚 -乙酸乙酯（95：5）洗脱，判断三者流出色谱柱 先后顺序。
(1) 分离效果高 (2) 应用范围广 (3) 选择性强 (4) 设备简单
色谱法的缺点是处理量小、操作周期 长、不能连续操作。
第二节 吸附色谱法
吸附色谱法(adsorption 差异而分离的方法。
chromatography，
AC)是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的
固体吸附剂，如有较强极性硅胶、中等极性
层 析 缸
薄层板 展开剂
层 析 缸
薄层板
4) 显色
显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开
后的混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置
(1) 紫外线照射法 (2) 喷雾显色法 (3) 碘蒸汽显色法 (4) 生物显迹法
2.吸附柱色谱分离操作及设备
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
(1) 色谱柱的选择
(0.1~10g)和工业生产规模(>10g)。色
谱分离的规模小，但产值高。
三、色谱法的分类
根据流动相的相态不同:
气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
(4) 洗脱
在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱 剂，进行剃度洗脱，各组分先后被洗出。 若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常 为50mL。 现多采用薄层色谱或纸色谱定性检查各 流分中的化学成分组成。 含单一色点的部分用合适的溶剂结晶； 仍为混合物的部分进一步寻找分离方法 再进行分离。
(2) 装柱
①干法装柱 在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地 撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大 小合适的玻璃砂芯。
打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入 柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松 紧一致
将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至 刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。
②湿法装柱
在色谱过程中，分配 系数大的溶质在固定 相上存在的概率大， 随流动相移动速度小。 由此，溶质之间由于 移动速度的不同而得 到分离。
3. 色谱一般过程
色谱操作中互不混溶的 两相分别称为固定相和 流动相。固定相填充于 柱内形成固定床，在柱 的入口端加入料液后， 连续输入流动相，料液 中溶质在流动相与固定 相之间扩散传质，产生 分配平衡
3.影响吸附分离的因素
①和功能基极性有关。极性增加的顺 序：烷烃、不饱和烃、醚、酯、酮、 醛、醇、酚和羧酸，同一类化合物极 性基团越多，极性越大。 ②小分子的化合物比大分子的化合物 极性大。 ③和某些细微结构有关，如氢键、异 构体等。
二、吸附色谱分离操作及其设备
1.薄层吸附色谱分离操作及设备 （1）薄层色谱板的制备 （2）点样 （3）展开 （4）显色
展开方式可分三类：
(1)上行展开法 最常用 就是使展开剂从下往上爬行展开； (2) 单次展开法和多次展开法 (3) 单向展开法和双向展开法
薄层色谱法 (Thin Layer Chromatography)
薄 层 板 玻璃板 上涂吸附剂层 SiO2 Al2O3
上行法
下行法
滤纸条 展开剂
聚酰胺膜多为外购商品。
2) 点样
用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶 液，在距薄层一端约2cm的起始线上点 样，每点间距约2cm，样品点直径一般
小于0.5cm。注意点样量要适中，太少
时，某些成分不能被检出；太多时容易产
生拖尾现象，即每个斑点都拉得很长，互
相重叠，不能分开。
3）展开
展开操作需要在密闭的容器中进行。 展开剂配好（2～10mL）倒入层析缸。 放置一定时间，待层析缸被展开剂饱和后，再 迅速将薄层板放入，密闭，展开即开始，这样 可防止边缘效应产生。 薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。 当溶剂移动到接近薄层上端边缘时，取出薄板， 划出溶剂前沿。
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为：
吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
三、色谱法的分类
根据操作压力的不同分类： 低压色谱：操作压力<0.5MPa 中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa 高压色谱：操作压力4.0～40MPa
四、色谱法的特点
图示
固定相——CaCO3颗粒 流动相——石油醚
色带
一、色谱过程
组 分 在 色 谱 柱 内 运 动
色谱柱
检测器
色谱图
色谱仪
溶质浓度分布
柱内：谱带
柱后：色谱峰
1.定义
色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分 配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离 的方法。
2 .色谱法的特点
分离效率高 可选操作参数多 应用范围广 高灵敏度的在线检测快速 分离与过程自动化操作
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂 吸附剂的选择
吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸
附能力，它对欲分离的不同物质应该有 不同的解吸能力； 与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化 学反应； 吸附剂颗粒均匀，操作过程中不会破裂。
(1)薄层色谱板的制备
①干法铺板(软板制备) 多用于氧 化铝薄层板的制备。在一块边缘整齐 的玻璃板上，铺上适量的氧化铝，取 一合适物品顶住玻璃板右端。两手紧 握铺板玻璃棒的边缘，按箭头方向轻 轻拉过，一块边缘整齐、薄厚均匀的 氧化铝薄层即成。
干法制板
(2)湿法铺板(硬板制备)
可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板 的制备，但最常用的是硅胶硬板。为使 制成的硅胶板坚硬，要加入黏合剂，用 硫酸钙为粘合剂铺成的板称为硅胶G板， 用羧甲基纤维素钠作黏合剂铺成的板为 硅胶-CMC板。ຫໍສະໝຸດ （1）薄层色谱的吸附剂与展开剂
薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化 铝、硅胶和聚酰胺。 色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒 度范围，不同吸附剂用于分离不同类 型的化合物。
吸附剂还必须具有一定的活度，活度 太高或过低都不能使混合物各组分得 到有效的分离。
展开剂
基本原则主要有两个： ①展开剂对被分离组分有一定的解吸 能力，但又不能太大。 ②展开剂应该对被分离的物质有一定 的溶解度。
第7章 色谱分离技术 第一节概述
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
色谱现象
In 1903，俄国植物学家Michael Tsweett’s Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384). Chromatography = (chromatus = color, graphein = to write).
第三节 凝胶色谱法
凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一
种分离技术，又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、 分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。 优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不 稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。
缺点：分离速度较慢。
一、基本原理
小分子物质可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还 可以进入凝胶颗粒的微孔中，如此不断地进 入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大 分子物质，从而使样品中分子大的先流出色 谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后 流出，这种现象叫分子筛效应。
阻滞因数
①0≤Rf≤1 Rf越大，溶质随流动相
移动快，被洗脱速率也就越快。
②当Rf=1，此种溶质不溶于固定相，
随流动相以同样的速率移动。 ③当Rf=0，此种溶质不溶于流动相， 而被吸附在固定相上。
2.吸附剂与展开剂
选用吸附色谱法分离化合物时，必须 首先了解被分离化合物的性质，然后 选择合适的吸附剂和展开剂。被分离 化合物、吸附剂和展开剂三者关系配 合恰当才能得到较好的分离效果。
色谱柱通常用玻璃柱。工业上用金属制造。
柱入口端应该有进料分布器，使进入柱内 的流动相分布均匀。 色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持 一段缓冲液层。 柱底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃 板，最简单的也可以用铺有滤布的橡皮塞。
设计柱长时需考虑下列几点：