菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

14食安(1)班赖玉健201430520106 孙涵治201430520119 杨泽杰201430520124 熊渠201430560525 14食安(5)班李炽斌201430520510菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

14食安(1)班杨泽杰

摘要:本文结合考马斯亮蓝G250染色法,研究了不同纯化方法,包括硫酸铵沉淀法、透析法,对菠萝蛋白酶活性的影响。实验结果表明,两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶,但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。

关键词:菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性

前言

菠萝蛋白酶(Bromelain,EC 3.4.22.3)简称菠萝酶,是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶,它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白,是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物,因含有一个不稳定的游离巯基,所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000,等电点 9.55,最适pH在7.1左右,在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大,维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂,EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶,有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂,能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症,它能帮助迅速结痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

14食安(1)班赖玉健201430520106 孙涵治201430520119 杨泽杰201430520124 熊渠201430560525 14食安(5)班李炽斌201430520510

1 实验材料与仪器

1.1实验材料与试剂

1.1.1 实验材料

新鲜菠萝(3个),透析袋

1.1.2 实验试剂

(1)盐析粗提液

0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL),0.01mo1/L pH

7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL)

(2)酶活力测定试剂

1%酪蛋白(进口分装)(配100mL),激活剂[含20mmo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)] ,10%三氯乙酸(TCA)

1.2实验仪器和用品

1.2.1实验仪器

HJ-6多头磁力搅拌器:常州国华电器有限公司

MC-H18S012多功能红外炉:广东美的生活电器制造有限公司

DS-1高速组织捣碎机:上海标本模型厂

GKC110R2可控硅恒温水浴锅:赏花锦屏仪器仪表有限公司

TD5M低速离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司

TDL-60B台式离心机:上海安亭科学仪器厂

722型可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司

UV5100B型紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司

PL1502-S电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司

BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司

BCD-539WT冰箱:青岛海尔股份有限公司

1.2.2实验用品

(1)以组为单位的用品

14食安(1)班赖玉健201430520106 孙涵治201430520119 杨泽杰201430520124 熊渠201430560525 14食安(5)班李炽斌201430520510大试管18mm×200 mm(10支)、试管架(2个)、烧杯(50mL×1,

100mL×2,200mL×1)、滴管(2支)、玻璃棒(2支)、移液管

(5mL×1,1mL×2,0.1mL×1,0.2 mL×1)、漏斗(3个)、量筒

(100mL×1)、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、

标签纸、橡皮筋。

(2)全班共用的用品

试剂瓶(1000mL×7,250mL×3,60mL×20)、烧杯(1000mL×4)、

塑料烧杯(2000mL×2)、量筒(500mL×2,1000mL×2)、广泛

pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋(截留相对分

子质量8 000~14 000)。

2实验方法

2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取

称取菠萝皮材料30g,将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中,加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS,持续搅拌10~15min至粉碎,搅拌完成后用4层纱布过滤,得到滤液后,用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min,弃沉淀,即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。

2.2盐析

根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”,按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量,称取固体硫酸铵于研钵中,研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵,边加边搅拌,使溶液最终硫酸铵饱和度为30%,放置于冰水混合物(4℃)30min 后,酶蛋白沉淀析出,4°

C 4000rpm离心10min,收集沉淀,加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至

完全溶解,测定其体积、蛋白质含量和酶活性[2]。

2.3透析

14食安(1)班赖玉健201430520106 孙涵治201430520119 杨泽杰201430520124 熊渠201430560525 14食安(5)班李炽斌201430520510将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋(预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min)中,于 500mL 烧杯中,在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析,15min换水一次,换水3~4次后,检查SO42-是否已被除净(检查的方法是:取2mLBaCl2溶液放入一支试管,滴加2~3滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示SO42- 未除净,若无沉淀出现,表示透析完全)。若透析液有沉淀,将透析液用滤纸过滤,测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性[3]。

2.4酶活性测定方法

取2支试管,设置一支为实验对照,三支为平行样品。取0.1mL酶液,加入0.9mL激活剂,加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL,准确反应10min,加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液,后加酪蛋白溶液,其它与测定管相同。离心(3000r/min,5min)或过滤,清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义:在上述条件下,每10min增加

0.001个光吸收值为1个酶单位(U)。

实验步骤按照表格中完成。

2.5蛋白质含量测定方法

2.5.1标准曲线的绘制

0~1000μg/mL标准曲线的绘制:另取6支试管编号,按下表加入试

剂。

相关文档
最新文档