成像流式细胞仪检测细胞自噬水平研究
自噬的WB检测指标的研究思路及方案
自噬的WB检测指标的研究思路及方案一、技术简介1. 微管结合蛋白1A/1B-轻链3的检测目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过Western blot检测microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平，但是如果没有自噬工具药作为对照，则观察到的LC3B改变无法真实反映细胞内自噬流状态。
例如LC3B-II增加既可能是自噬活化后自噬小体增多而成，也可能是自噬溶酶体清除失败所致。
自噬流的检测方法较为复杂，单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统性检测自噬流，因此需要选择多种不同实验方法，综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。
2. 使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂，通过检测LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标。
当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (bafilomycin A1, Baf A1)刺激细胞时，细胞内自噬溶酶体降解被抑制，此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。
当细胞自噬流活化后，LC3B-II的含量会在使用Baf A1的基础上进一步增加，而当细胞自噬流阻断后，LC3B-II的含量则不会在使用Baf A1的基础上发生改变。
除Baf A1夕卜，其他一些能提高溶酶体pH 值的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测。
若待检测药物+Baf A1组LC3B-II与仅Baf A1处理组相比显著增加则代表所检测药物可以增加自噬小体或自噬溶酶体的合成。
相反，若处理组与对照组相比，LC3B-II 降低则代表处理药物减少自噬小体的合成。
3. 应用GFP-LC3B剪切实验评价自噬流GFP-LC3B融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测，还可利用溶酶体对标签蛋白的切割通过Western blot进行检测。
GFP- LC3B 蛋白进入到自噬溶酶体内后LC3B部分对溶酶体中的蛋白水解酶较为敏感，较容易被降解。
流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的方法学探讨_陈东亚
成像流式细胞仪操作流程
成像流式细胞仪操作流程流式细胞仪是一种广泛应用于生物学研究领域的仪器，可以用来对单个细胞进行高速、高灵敏度的分析和检测。
成像流式细胞仪是其一种新型的变种，结合了传统流式细胞仪的流式分析功能和显微镜成像功能，能够对细胞形态、结构和功能进行直接观察和分析。
本文将介绍成像流式细胞仪的操作流程。
一、准备工作1. 清洁工作台和操作仪器，确保工作环境整洁。
2. 准备所需的实验材料，包括培养基、细胞样品和标记抗体等。
3. 打开成像流式细胞仪的电源，等待其初始化完成。
二、调试参数1. 根据实验需要，设置激光器和滤光片的参数，确保光源的波长和强度适合所需观察的标志物。
2. 调整放大倍率和对焦距离，以保证成像的清晰度。
3. 根据细胞样品特点，设置流速和吸光度的阈值，以获得最佳的成像效果。
三、样品处理1. 获取细胞样品，可以通过培养基中的细胞培养、动物组织提取等方式获得。
2. 用适当的缓冲液将细胞样品悬浮均匀，避免细胞团聚。
3. 如有需要，可以使用荧光染料或标记抗体对细胞进行标记，以便观察特定的结构。
四、样品加载1. 将处理好的细胞样品转移到流式细胞仪的试剂管中。
2. 将试剂管放入样品流动系统中，并将样品连接到成像流式细胞仪。
3. 开启样品注入泵，使样品流入流动系统，确保样品稳定地流过激光器和成像仪。
五、数据采集与分析1. 在计算机上打开成像流式细胞仪的控制软件。
2. 设置采集参数，包括曝光时间、图像大小等。
3. 开始采集数据，成像流式细胞仪会自动将细胞图像采集下来，并存储在计算机中。
4. 对采集到的细胞图像进行分析和处理，可以量化细胞形态参数和标志物表达水平。
六、数据解读与结果分析1. 根据实验的研究目的，对采集到的数据进行解读和分析。
2. 结合其他实验结果和文献资料，判断细胞样品中的结构和功能特点。
3. 根据分析结果，得出相应的结论，并编写相应的研究报告或论文。
七、清洁与关闭1. 实验结束后，关闭流式细胞仪的电源。
检测自噬的实验方法
检测自噬的实验方法一、形态学检测。
1. 透射电子显微镜（TEM）- 这可是检测自噬的“金标准”呢。
就像用一个超级放大镜去看细胞内部。
自噬的时候啊，细胞里会形成自噬体，这个自噬体在TEM下有它独特的样子，双层膜结构，里面包着要降解的东西。
不过呢，TEM也有点小麻烦，它的样品制备不容易，就像做一道超级精细的菜，得小心翼翼的，而且对仪器要求也高，就像开豪车得有好的路况一样。
2. 荧光显微镜检测。
- 可以用一些标记自噬相关蛋白的荧光染料。
比如说LC3蛋白，它可是自噬的一个重要标志。
当细胞发生自噬的时候，LC3 - I会变成LC3 - II，并且会定位到自噬体膜上。
我们就可以用带有绿色荧光的标记物去标记LC3，然后在荧光显微镜下看。
就像给自噬体穿上一件绿色的小衣服，在黑暗里用特殊的灯一照就能看到啦。
这种方法相对简单一些，就像穿休闲装出门，没那么多繁琐的步骤。
二、生化检测。
1. 检测自噬相关蛋白的表达水平。
- 像Western blot就可以用来检测自噬相关蛋白的变化。
比如前面说的LC3蛋白，还有p62蛋白。
p62蛋白是自噬的底物，如果自噬正常进行，p62蛋白的水平会下降，因为它被自噬体降解了。
这就像看一个东西的库存一样，如果一直在消耗，库存就会减少。
通过检测这些蛋白的表达量的变化，就能知道自噬是不是在正常工作啦。
2. 检测自噬流。
- 可以用一些试剂来阻断自噬体和溶酶体的融合，然后看自噬相关蛋白的变化。
如果自噬流是正常的，阻断之后自噬体就会堆积，相关蛋白的表达也会有相应的改变。
这就像是在水管中间堵一下，看看水是不是真的在流，在哪个地方堵住了一样有趣呢。
细胞自噬的研究方法
细胞自噬的研究方法一、本文概述细胞自噬是一种细胞内自我降解和再循环的过程，通过这一过程，细胞能够清除受损、老化或多余的细胞器及蛋白质，从而维持细胞内部环境的稳态。
近年来，随着对细胞自噬机制的深入研究，其在生物学领域的重要性日益凸显，成为了生命科学研究的热点之一。
本文旨在探讨细胞自噬的研究方法，包括细胞自噬的监测技术、诱导与抑制方法，以及研究细胞自噬在疾病发生发展中的作用等。
通过本文的阐述，希望能为从事细胞自噬研究的科研人员提供有益的参考和借鉴，推动细胞自噬研究领域的深入发展。
二、细胞自噬的基本过程与机制细胞自噬是一种细胞内降解和回收细胞质组分和细胞器的重要过程，对维持细胞稳态和适应环境变化具有关键作用。
自噬的基本过程可以分为几个关键步骤，包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及自噬体内物质的降解。
自噬体的形成是自噬过程的起始阶段。
在这一阶段，细胞内的双层膜结构（称为吞噬泡或自噬泡）开始延伸并包裹待降解的细胞质组分或细胞器。
这一过程受到多种自噬相关基因（ATG）编码的蛋白质的调控。
一些关键的ATG蛋白，如ATG5和ATG12，参与自噬体膜的延伸和闭合。
接下来，自噬体与溶酶体融合，形成一个自噬溶酶体。
在这一步骤中，自噬体的外膜与溶酶体的膜融合，释放出自噬体内的物质进入溶酶体的酸性环境。
溶酶体中含有多种水解酶，这些水解酶能够降解自噬体内的蛋白质、脂质和糖类等有机物。
自噬体内物质的降解是自噬过程的最后阶段。
在自噬溶酶体中，水解酶将自噬体内的物质分解为小分子，如氨基酸、脂肪酸和单糖等。
这些小分子可以被细胞重新利用，以支持细胞的代谢活动和生长需求。
除了上述基本过程外，细胞自噬还受到多种信号通路的调控。
例如，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路是调控自噬的两个重要通路。
mTOR通路在营养充足时抑制自噬，而在营养不足时则促进自噬的发生。
AMPK通路则在能量不足时激活自噬，以提供能量来源。
自噬流的检测方法
自噬流的检测方法一、本文概述自噬流是一种细胞自我消化和再生的过程，对于维持细胞稳态和适应环境变化具有重要意义。
随着生物学研究的深入，自噬流的检测已成为研究细胞自噬机制的重要手段。
本文旨在综述自噬流的检测方法，包括常用的生物化学方法、显微成像技术以及基于流式细胞仪的分析等。
我们将详细介绍这些方法的原理、操作步骤、优缺点以及应用实例，以期为自噬流研究提供全面的技术支持和参考。
通过本文的阅读，读者可以深入了解自噬流检测的原理和方法，掌握自噬流研究的最新进展，为相关研究提供有益的借鉴和指导。
二、自噬流的基本概念和机制自噬流（Autophagic Flux）是细胞自噬过程的一个核心概念，它描述了从自噬体的形成、自噬底物的降解，到降解产物的再利用这一连续过程。
自噬是一种细胞内的降解途径，通过这一过程，细胞可以将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或其他细胞内组分包裹在双层膜结构的自噬体中，并运送到溶酶体进行降解，从而实现物质的循环利用和细胞的稳态维持。
自噬流的基本机制涉及多个关键步骤。
细胞在感受到饥饿、缺氧或其他压力信号时，会启动自噬过程。
随后，自噬相关基因（Autophagy-related genes, ATGs）及其产物会参与自噬体的形成。
这些自噬体通过膜延伸和闭合，将待降解的底物包裹在内。
形成成熟的自噬体后，它们会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。
在自噬溶酶体中，自噬体的内膜及其包裹的底物会被溶酶体中的水解酶降解，释放出氨基酸、脂肪酸等小分子物质。
这些降解产物随后会被细胞重新利用，以支持细胞的生存和代谢活动。
自噬流的顺畅进行对于细胞的正常生理功能至关重要。
它不仅可以清除细胞内的有害物质和受损组分，还可以为细胞提供能量和营养物质，以应对各种环境压力。
因此，研究自噬流的检测方法对于理解自噬的生理和病理作用，以及开发相关疾病的治疗策略具有重要意义。
三、自噬流检测方法的分类与特点自噬流的检测是理解自噬过程的关键环节，其方法多种多样，各具特点。
细胞自噬流数据统计分析
细胞自噬流数据统计分析
细胞自噬是一种细胞内的代谢过程，涉及到多个相关蛋白质和信号通路，因此流数据统计分析可以帮助我们更全面地了解细胞自噬过程。
以下是可能需要进行的流数据统计分析：
1. 细胞自噬相关蛋白质表达：使用Western blot等方法检测细胞中自噬相关蛋白质（如LC3、p62、Beclin-1等）的表达水平，对比实验组和对照组并进行差异分析。
2. 细胞自噬程度：使用转染GFP-LC3等荧光探针标记自噬小体，通过荧光显微镜观察自噬小体数量和大小的变化，并进行荧光强度的统计分析。
3. 细胞自噬相关信号通路：使用RT-qPCR等方法检测细胞自噬相关信号通路（如mTOR、AKT、AMPK等）的mRNA水平变化，对比实验组和对照组并进行差异分析。
4. 细胞自噬和细胞凋亡：使用细胞凋亡标记染料如Annexin V和PI等，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，并分析自噬和细胞凋亡之间的相关性。
以上是一些可能需要进行的流数据统计分析，具体方法可以根据实验设计和需要进行选择。
流式fitc和pi四象限
流式fitc和pi四象限流式fitc和pi四象限实验是研究细胞生命周期及死亡等现象的一种常用手段，也是目前生物学研究中不可或缺的分析技术。
下面为大家详细介绍流式fitc和pi四象限的相关内容。
一、什么是流式fitc和pi四象限实验？流式fitc和pi四象限实验是通过流式细胞仪检测荧光素FITC 和PI染色的细胞数量，来分析细胞的生命周期和死亡等现象的一种实验方法。
其中，FITC染色可以反映细胞活性和成分变化，PI染色可以反映细胞核酸含量和形态变化。
二、流式fitc和pi四象限实验的原理及步骤1、实验原理流式fitc和pi四象限实验是基于细胞状况的荧光信号来进行分析，首先通过FITC和PI染色将细胞分类，然后在流式细胞仪中进行检测得到荧光信号。
2、步骤（1）取相应数量的细胞，进行细胞处理，并用PBS冲洗一次去除培养基和残留药物等。
（2）将细胞溶解液均匀加入每个实验管中，加入FITC染液和PI 染液，使细胞达到充分染色。
（3）经过染色后，用PBS进行冲洗，去除残留的染料和重复的细胞。
（4）将实验管放入流式细胞仪中进行检测，得到其中包含的荧光信号。
三、流式fitc和pi四象限实验的应用领域流式fitc和pi四象限实验被广泛应用于生物学研究中，特别是在细胞周期和细胞死亡中的应用更为广泛。
其应用领域包括：（1）研究细胞凋亡、坏死、自噬等现象。
（2）分析细胞周期。
（3）研究细胞中分子、化合物的吸收、转运等。
（4）检测细胞膜的表达。
（5）研究肿瘤、癌症等疾病的发生机制。
以上是流式fitc和pi四象限实验的相关介绍，这种实验方法使得研究者可以更加深入地探究细胞的相关问题，为广大生物学研究者提供了重要的实验手段。
线粒体自噬的检测方法
线粒体自噬的检测方法
线粒体自噬的检测方法主要有以下几种：
1.透射电镜技术（TEM）：这是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段。
透射电镜可以观察到线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的形成和结构特征，从而判断自噬是否发生。
2.荧光显微镜技术：通过荧光标记的方法，可以观察线粒体自噬的动态过程，例如使用荧光探针标记技术对线粒体和自噬体进行共定位。
此外，还可以使用特定的荧光蛋白或探针来标记线粒体自噬相关蛋白或线粒体膜电位等，从而间接反映线粒体自噬活性。
3.流式细胞术：可以用来检测线粒体膜电位、线粒体总量以及免疫印迹技术检测线粒体自噬相关蛋白表达量的变化，从而间接反映线粒体自噬活性。
4.蛋白质印迹技术：通过检测线粒体自噬相关蛋白的表达水平，可以间接评估线粒体自噬的活性。
细胞自噬检测
2.5细胞裂解细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。
所有操作在冰上进行。
最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中。
把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中。
根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一200川TAPBu价r)。
放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。
在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一步实验，丢弃沉淀。
2.13细胞自噬活性的检测我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理，二药物RaPamycin处理。
对于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。
在37“C培养箱中培养2一4h。
对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。
细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一条是通过转染GFP一LC3，再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。
二是用westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。
对于荧光显微镜分析，在U20S细胞中转染GFP一LC3，24h之后，把细胞继代培养在有盖玻片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1次，在每个孔内加入3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片20min。
用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃10min，用固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之后用荧光显微镜观察。
对于westemblotting，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的细胞，加入1‘SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止，95“e煮沸样品5min，室温下高速(100009)离心5min，通过SDs一pAGE并用LC3的抗体(sigma)进行westemblotting 检测，自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高。
自噬流的检测方法
自噬流的检测方法吕晓希, 胡卓伟*(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室(BZ0150), 北京100050)摘要: 自噬是调节真核细胞生长、死亡、能量代谢的重要生物学机制。
细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的活化。
大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病，特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关，目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。
由于自噬流是一个由多个步骤组成的动态过程，因此往往需要精细的实验才能准确判断自噬流状态。
本文将介绍自噬流的基本概念并总结目前常规使用的自噬流检测方法。
这些方法将有助于自噬生物学机制的研究，并为自噬相关药物筛选提供有效的解决方案。
关键词: 自噬流; 流式细胞术; 串联荧光; 长寿命蛋白; 微管结合蛋白1A/1B-轻链3中图分类号: R965.2 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870(2016)01New methods to detect autophagic fluxLVXiao-xi, HUZhuo-wei*(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study (NO. BZ0150), Institute of Meteria Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 100050 Beijing, China)Abstract: Autophagy is a crucial biological process for eukaryotes, which is involved in cell growth, survival and energymetabolism, while the premise of the autophagy function is activated autophagic flux. It has been confirmed that impaired autophagic flux promotes pathogenesis of many chronic inflammatory diseases, especially cancer, neurodegenerative disease and tissue fibrosis, therefore the analysis of autophagic flux state is important for revealing autophagy function and the收稿日期: 2015-10-09; 修回日期: 2015-11-10.基金项目: 国家自然科学基金项目(81503128), 中央级公益性科研院所基本科研业务费-创新药物与新技术专项(2014CX09).*通讯作者Tel/Fax:86-10-83165034,E-mail:****************.cnmechanism of autophagy related diseases. Given that autophagy is a dynamic process with multiple steps, it is very hard to observe the real state of autophagic flux. Summarized here is the novel concept and current approach to detect autophagic flux. This knowledge is crucial for the reaching of the biological function of autophagy, and provides some strategies for development of autophagy-targeting durg.Key words: autophagic flux; flow cytometry; tandem fluorescent; long lived protein; microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3大自噬是真核细胞降解长寿蛋白、错误折叠蛋白和受损细胞器的重要生物学过程[1]。
鉴定细胞发生自噬的方法
鉴定细胞发生自噬的方法自噬（Autophagy）是指细胞破坏自身细胞内器官或者物质的一种自我降解机制，它不仅参与清除自身内部旧无用、损坏的器官或物质，还可以提供细胞必要的能量，在细胞增殖、分化和死亡等过程中，都发挥着重要的作用。
研究发现，很多疾病的发生或进展，都与自噬发生的失调有直接关系，所以有必要研究鉴定细胞发生自噬的方法。
鉴定细胞发生自噬的方法大体有三类：一是可视化鉴定；二是信号通路检测；三是其他生物学方法。
首先，可视化鉴定是利用显微镜观察细胞内物质吞噬变化的方法。
通过对比实验，可以得出细胞发生自噬所产生的可视化变化，从而鉴定该细胞是否发生了自噬。
一般常用的方法有荧光染色和免疫荧光定位法。
荧光染色是利用伴随自噬过程的蛋白质把具有荧光性质的碱基染色，再利用改变荧光强度的抗体或者小分子探针监测细胞内蛋白质变化的方法；免疫荧光定位是利用荧光标记抗体把自噬与其他发生机制分离开来，结合成像技术，直接地观察细胞内发生自噬，移动和分布的情况。
其次，信号通路检测是指利用多种基因表达方法检测与自噬相关的信号通路，以确定细胞是否发生了自噬变化。
常用的基因表达技术有定量聚合酶链反应（Q-PCR）和蛋白质印迹分析（Western blot）。
定量聚合酶链反应（Q-PCR）是利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的技术，在组织或细胞样本中测定与自噬有关的基因表达水平；蛋白质印迹分析（Western blot）是质谱技术分析细胞内蛋白质组成和变化，从而检测细胞发生自噬的情况。
最后，还有一些其他生物学方法，如细胞模型实验和动物实验，可以用来鉴定细胞发生自噬的情况。
细胞模型实验是指利用细胞模型来模拟实际自噬过程，有助于发现和验证自噬的分子机制；而动物实验则是利用动物模型，观察动物模型细胞是否发生自噬，有助于研究自噬在疾病机理中的作用。
综上所述，鉴定细胞发生自噬的方法主要有可视化鉴定、信号通路检测以及其他生物学方法。
不同的方法有不同的优势，结合各种方法可以更好地研究自噬发生的机制，为自噬与疾病进行有效的防治奠定基础。
细胞自噬 流式成像分析
Figure 1: The Bright Detail Intensity R7 feature in IDEAS 5.0 software computes the intensity of bright spots with radii of 7 pixels or less.645 Elliott Avenue West, Suite 100 Seattle, WA 98119 USA Phone: +1 206 374 7000© 2012 Amnis Corporation, Seattle, WA USA. FlowSight and IDEAS are registeredtrademarks of Amnis Corporation. AN4498ENOO / 12-004-1Bright Detail IntensityAs shown in Figure 2, a statistically significant increase in the Bright Detail Intensity R7 feature was observed upon treatment.ConclusionThe data above demonstrate a useful method for assessing autophagy using the FlowSight imaging flow cytometer and its companion IDEAS data analysis software, and has beenFigure 2: Histograms for the control non-starved and starved cells are shown, along with representative images of the selected regions. brightfield image and a composite of the Low BDI Control CellsHigh BDI Starved Cellsvalidated on the ImageStream platform as well 1. Imaging flow cytometry provides more functional information than conventional flow cytometry thanks to the addition of morphologic data, while offering greater statistical rigor than fluorescence microscopy thanks to its ability to image up to several thousand cells per second.1. De la Calle C, et all., Autophagy 7:9, 1-7; September 2011.1e3 1e4BF RFP/DAPI BF RFP/DAPIBF RFP/DAPI BF RFP/DAPIBF RFP/DAPI BF RFP/DAPIBF RFP/DAPI BF RFP/DAPI10.80.60.40.20Bright Detail Intensity。
自噬研究：快到碗里来！
自噬研究：快到碗里来！作者：右哉最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。
这篇文章的题目是：'Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy'，基本上可以作为入门级自噬研究的参考模板了。
文章思路是这样的：首先文章证明了EPI能诱导肝癌细胞自噬，而UTI能抑制这样的自噬；然后UTI能促进EPI诱导的细胞凋亡；接着证明UTI是抑制自噬从而促进了EPI诱导的凋亡；然后证明了UTI是通过NF-kB信号通路起到了这样的作用；最后做了一下成瘤实验。
我们就看第一个Fig，就基本能了解自噬他们究竟做了点啥。
自噬研究基本可以分这样几个层次：1.证明自噬参与了你的研究表型：western检测LC3，p62；LC3双荧光测细胞自噬流；电镜观测自噬；自噬形成时胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
但LC3的抗体会对LC3-II有更高的亲和力，所以往往会造成假阳性。
所以通常会使用LC3的亚细胞结构定位来辅助实验。
比如这篇文章所采用的就是HanBio Inc.（汉恒生物）的mRFP-GFP-LC3的腺病毒进行分析的。
2.证明自噬在你的表型中起了关键作用：加自噬抑制剂3-MA，激动剂rapamycin等，然后检测表型（功能）；这里就用到了两种自噬抑制剂：3-MA和CQ（Chloroquine）。
3.找到表型与自噬衔接的分子：检测自噬通路如pI3K 通路，Beclin-1，ATG家族各成员,看看哪个与表型呈现正相关变化;4.基因操作3中的分子,检测自噬和表型：说明该分子在衔接自噬和表型中的作用机制;这一点需要运用到的也就是柯霍氏法则和回复实验。
…华丽丽的分割线…李莫愁博士：而普通的自噬研究，也就是这样一个模式：（感谢汉恒生物的蔡博士为我们整理）自噬表型研究中，较为常用的就是采用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，对细胞进行了感染。
细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用
细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用细胞自噬是一种重要的生物过程，它涉及到细胞内受损或多余物质的降解和再利用。
近年来，细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到。
本文将探讨细胞自噬如何影响肿瘤的发生、发展和治疗，并讨论这一领域的未来研究方向。
细胞自噬是一种高度保守的生物学过程，它通过溶酶体途径降解细胞内受损的蛋白质、脂质和衰老的细胞器等。
细胞自噬在细胞代谢、免疫应答和应激反应等方面具有重要作用。
在肿瘤发生发展过程中，细胞自噬的失调也扮演了重要角色。
许多研究表明，细胞自噬在肿瘤发生中具有保护作用。
在致癌因子作用下，细胞自噬可以通过降解受损的细胞器和蛋白质，减少细胞内突变积累，从而防止细胞恶性转化。
然而，在某些情况下，细胞自噬也可能促进肿瘤的发生。
例如，在基因突变导致的肿瘤中，细胞自噬可能无法有效降解突变蛋白，从而促进肿瘤的发展。
在肿瘤发展过程中，细胞自噬的作用具有双重性。
一方面，细胞自噬可以通过降解癌细胞的多余或受损成分，抑制肿瘤的增殖和扩散。
另一方面，细胞自噬也可以促进肿瘤的适应性和抵抗性，帮助肿瘤细胞逃避免疫监视和抵抗化疗药物。
研究发现，一些肿瘤细胞可以利用细胞自噬来适应缺氧和营养缺乏等不利环境，从而促进肿瘤的恶性生长。
细胞自噬的调控机制十分复杂，包括基因突变、信号转导等多种因素。
在肿瘤发生发展过程中，一些关键基因和信号通路的改变可能影响细胞自噬的功能。
例如，抑癌基因Beclin 1和BCL-2的相互作用是调节细胞自噬的关键环节之一。
mTOR信号通路和HIF-1α信号通路也在细胞自噬调控中发挥重要作用。
虽然我们对细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用有了更深入的了解，但仍然存在许多未知领域需要进一步研究。
未来的研究方向包括：深入探讨细胞自噬在特定肿瘤类型中的作用及其机制，例如在不同类型的肺癌、乳腺癌和结直肠癌中，细胞自噬的作用可能存在差异。
研究细胞自噬与其他生物学过程如凋亡、坏死和免疫应答之间的相互作用，以及这些相互作用在肿瘤发生发展中的意义。
细胞自噬检测的具体步骤及方法
细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法⼀、⾃噬体介绍⾃噬（Autophagy），或称⾃体吞噬，是⼀个涉及到细胞⾃⾝结构通过溶酶体机制⽽被分解的过程，该过程是⼀个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持⼀个平衡状态。
细胞接受⾃噬诱导信号后，在胞浆的某处形成⼀个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。
随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“⾃噬体（autophagosome）”。
⾃噬体形成后，可与溶酶体融合，⾃噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利⽤，⽽残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
⾃噬信号通路：⼆、⾃噬研究策略和⽅法正常细胞基础⽔平⾃噬活性⽐较低，对⾃噬研究通常需要进⾏⼈⼯调节和⼲预，常⽤药物有：1、⾃噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质⽹应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。
2、⾃噬抑制剂a) ⾃噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质⼦泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。
3、⾃噬检测1) 透射电镜；电镜作为⾃噬检测的⾦指标。
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相 关 蛋 白轻 链 ３ （ Ｌ Ｃ ３ ） 表 达 质 粒 转 染 Ｈｕ ｈ ７细 胞 和 Ｈ１ ２ ９ ９细 胞 ， 并进 行 ２ ４ ｈ饥 饿 处理 ， 诱 导 自噬 发 生 ， 分 别 用 荧光 显 微 镜 拍 照 、 蛋
国际检 验 医学杂志 ２ ０ １ ６ 年 ｌ １ 月第３ ７ 卷第２ １ 期
Ｉ ｎ ｔ Ｊ Ｌ ａ ｂＭｅ ｄ ， Ｎ ｏ ｖ ． ２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ７ ， Ｎ ｏ ． ２ １
・
论
著 ・
成像 流 式 细胞 仪 检 测 细胞 自噬水 平研 究
时景 仁 ， 郭 向华 ， 王珊珊 ， 刘 凯 ， 乔 录新 ， 张玉林 ， 陈德 喜△ （ 首都 医科 大 学附属 北京佑 安 医院／ 北 京市肝 病研 究所 ， 北京 １ ０ ０ ０ ６ ９ ）
白免 疫 印 迹 法 和 成 像 流 式细 胞 术 ３种 方 法检 测 细胞 自噬 水平 。 用 Ｉ ＤＥ Ａ Ｓ软 件 对 成像 流 式 细胞 术 的 细胞 自噬 结果 进 行 量 化 分析 。 结 果 荧光 显 微 镜 显 示 ， Ｈｕ ｈ ７细胞 比 Ｈ１ ２ ９ ９细胞 中 的 自噬 斑 点 少 ； 蛋 白 免 疫 印迹 法 显 示 ， 与 Ｈ１ ２ ９ ９细 胞 比 较 ， Ｈｕ ｈ ７细 胞 Ｌ Ｃ ３ 一 Ⅱ与 Ｌ Ｃ ３ － Ｉ比例 较 低 ， 但 ２种 方 法 均 不 能 获得 通 量 统 计 数 据 。成 像 流 式 细 胞 仪 结 果 显 示 细 胞 自噬 图像 ， ２种 细胞 的 Ｇ Ｆ 率基 本 一 致 （ ２ ５ ． ２ 和２ ７ ． ６ ） ； 比 较 两 者 发 生 高 水 平 自噬 （ Ｌ Ｃ ３斑 点 数 目 为 ６个 以 上 ） 的细胞 比例 ， Ｈｕ ｈ ７细 胞 仅 为 ９ ． ０ ， 显 著 少 于 Ｈ１ ２ ９ ９细 胞 （ ２ ６ ． ２ ） 。 结 论 采 用 新 型 成 像 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 自噬 ， 兼具 量化分析 和成像 的优点 ， 能 弥补 荧 光 显 微 镜 和 蛋 白免 疫 印迹 法 的 不足 ， 是 一 种 更 优 秀的 自噬 检 测 方 法 。 关键词 ： 自噬 ； 成 像 流 式 细胞 仪 ； 微 管 相 关 蛋 白轻 链 ３ Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ — ４ １ ３ ０ ． ２ ０ １ ６ ． ２ １ ． ０ ０ １ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ３ － ４ １ ３ ０ （ ２ ０ １ ６ ） ２ １ － ２ ９ ４ ９ — ０ ４
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