人生长激素的生产工艺 精品

人生长激素的生产工艺
生长素分为植物生长素和高等动物、人生长激素。

植物体内的生长素,其化学成
分是吲哚乙酸。

而高等动物和人体内的生长激素,其化学成分是蛋白质，不同种属的哺乳动物的生长激素间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长激素对人有活性。

因而动物的生长激素一般不能用在人身上。

人生长激素是脑垂体前叶分泌细胞分泌的蛋白质，是由一条191个氨基酸的多肽链
，所构成的蛋白质,分子中有两个二硫键,相对分子质量21700,等电点4.9，沉降系数S
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2.179，N端的1-134氨基酸段肽链为活性所必需，C端的一段肽链可能起保护作用，使w
生长激素在血循环中不致被酶破环。

人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冻条件下可保持数年，在室温放置48h无变化。

一、生长激素发展历程：
１：科学家早家1920年就知道了生长激素的存在，但直到1958年才被用于临床治疗。

直到1986年美国礼来大药厂通过基因工程方法，成功地制造出了191个氨基酸的HGH。

2：1985年，基于对HGH的多年研究和广泛深入的临床实验，美国威斯康辛医学院的罗德曼博士在《美国抗衰老协会杂志》上首次正式提出一个有关人体衰老原因的崭新理论。

3：1990年7月5日美国威斯康辛医学院的Daniel Rudman罗德曼医师在《新英格兰医学杂志》上发表了他那一篇震惊医学界的论文——Effects of human growth hormone in men over 60 years old（人类生长激素在60岁以上老年人中的应用），这篇论文可以说是HGH应用到抗衰老研究医学史上的一座里程碑。

4：1996年，爱德门钱博士在自己亲身体验到HGH的卓越效果后，扩展使用到超过800个患者，包括电影明星、大公司高级主管、甚至许多著名的医生、专家、学者，均达到惊人的效果。

1996年8月美国FDA（美国食品药品监督管理局）终于正式批准HGH在临床上使用，用来治疗所有缺乏HGH的病人，也包括正常成年人。

5：现在科学发现人体生长素HGH减少才会出现人体的衰老。

合理的补充人体生长素（HGH），可以使人体的衰老现象产生逆转。

二、人生长激素作用有：
1：有抗衰老作用
2：对人肝细胞有增加核分裂作用
3：对红细胞有抑制葡萄糖利用作用
4：对白细胞或淋巴细胞有促进蛋白质及核酸合成作用
5：有促进骨骼、肌肉、结缔组织和内脏增长作用
6：对垂体功能不全而引起的侏儒症有效。

三、人生长激素的传统工艺流程： 生产工艺流程
[提取]0.25mol/L 硫酸铵[提取]0.25mol/L 硫酸铵pH=5.5，离心人脑垂体前叶
上清液[分级沉淀],硫酸铵1-1.8mol/L [分级沉淀],硫酸铵1-1.8mol/L pH =7.5pH =7.5盐析物[溶解]
[溶解]蒸馏水蒸馏水溶解液[除盐]对蒸馏水[除盐]对蒸馏水透析透析透析内液
[除杂蛋白质]酸或碱[除杂蛋白质]酸或碱pH = 4.0和4.9，离心pH = 4.0和4.9，离心上清液[盐析]硫酸铵1.25mol/L [盐析]硫酸铵1.25mol/L pH = 4.0pH = 4.0盐析物[溶解]
[溶解]蒸馏水蒸馏水透析内液
[凝胶过滤]
SephadexG-75
[凝胶过滤]SephadexG-75pH = 8.5pH = 8.5活性组成[透析]对6.5mol/L 硼砂盐酸B 透析[透析]对6.5mol/L 硼砂盐酸B 透析pH = 8.7
pH = 8.7透析内液透析内液[洗脱]0-0.3mol/L NaCl 6.5mmol/L 硼砂-盐酸B [洗脱]0-0.3mol/L NaCl 6.5mmol/L 硼砂-盐酸B pH = 8.7
洗脱峰组分溶解液[除盐][除盐]对0.1mol/L NaCl,tris-HCl 透析对0.1mol/L NaCl,tris-HCl 透析[离子交换层析]DE-52[离子交换层析]DE-52pH = 8.7pH = 8.7吸附DE-52[除盐]
对蒸馏水透析[除盐]对蒸馏水透析透析内液[干燥]冻干
[干燥]冻干[-300C][-300C]生长素
工艺过程：
1：原料处理。

取出人脑垂体，速冻，置于-20℃保存备用。

使用时用蒸馏水淋洗。

剥离后叶，取腺垂体前叶。

2：提取。

pH= 5.5置组织捣碎机制成匀浆，水提，离心，收集沉淀用pH =4.0、0.1mol/L 硫酸铵提取，离心，然后用pH =5.5、0.25 mol/L 硫酸铵提取沉淀，离心，得提取液。

3：分级沉淀。

在pH =7.5时，提取液中加入饱和硫酸铵稀至浓度1 mol/L ，离心，弃沉淀，上清液加饱和硫酸铵稀至浓度为1.8mol/L ，离心，收集沉淀。

4：透析。

腺垂体[硫酸铵]→[pH =5.5]提取液[硫酸铵]→[pH =7.5]盐析物透析除盐、去杂蛋白 将沉淀溶于少量蒸馏水中，用水透析除盐。

5：等电点沉淀。

再将透析液在pH=4.0和pH=4.9分别进行等电点沉淀，离心，除去杂蛋白，得上清液。

盐析物[蒸馏水]→溶解液→透析液[HCl或NaOH]→[pH=4.0, 4.9]上清液。

6：盐析。

盐析、离心、洗脱上清液在pH=4时用饱和硫酸铵稀至1.25mol/L，盐析，离心，收集沉淀。

7：凝胶过滤。

将沉淀溶于少量蒸馏水，对pH =8.5的Tris-HCl缓冲液(含0.1mol/L 氯化钠)透析，再上SephadexG-75柱，用50mmol/L、pH= 8.5的Tris-HCl缓冲液(含0.1mol/L氯化钠)洗脱，分步收集组分。

上清液[硫酸铵]→[pH4.0]盐析物[透析]→[pH=8.5]透析液[SephadexG-75]→[pH=8.5]活性成分
8：DEAE-C（DE-50）层析。

透析、除盐、冻干将活性成分对pH= 8.7、6.5 mmol/L 的硼砂-HCl缓冲液进行透析，透析液上DEAE-C柱，用6.5 mmol/L、pH= 8.7的硼砂-HCl 缓冲液(含0-0.3mol/L氯化钠)梯度洗脱，收集组分，合并，透析除盐，冷冻干燥即得pGH。

活性成分[透析]→[pH=8.7]透析液[DEAE-C]→[pH=8.7]吸附物[洗脱]→[pH=8.7]洗脱峰组分[透析]→透析液[冻干]→[-30℃]pGH成品。

四、人生长激素现在生产工艺
现在生产工艺主要运用生物技术，有现采用枯草芽孢杆菌系统表达或用大肠杆菌表达系统，现主要介绍运用大肠杆菌表达系统
构建成表达重组人生长激素的
工程菌
pET30a( + ) -hGH/BL21 ( DE3)种子培养LB培养液
诱导和补料
发酵分析检测
hGH的纯化和纯度鉴定产品
发酵
1：构建工程菌pET30a( + ) -hGH/BL21 ( DE3 ),
2：种子液的制备。

从- 70 甘油冻存的菌种中取出少量接种于5ml 液体LB ( 含氨苄青霉素100ug/ml ) , 在37℃ 200r/min 振荡培养10 ~ 12h。

按1% 量再转接于100ml 液体LB ( 含氨苄青霉素100ug/ml ) , 在37℃ 200r/min 振荡培养8h 左右。

3:发酵培养。

培养基体积为4L, pH 控制在7.00 +/- 0.10, 由发酵控制系统自动补
入5mol/L NaOH 和2mol/L H
2SO
4
调节培养基pH。

培养温度控制在37 ℃。

发酵过程中溶氧
控制在20% 以上, 当溶氧降低至该值时可通过提高通气量和搅拌速度以提高溶氧。

4: 诱导和补料发酵。

当发酵进行到3.5~ 4h 后, 培养基中的葡萄糖几乎消耗完, 一次性加入IPTG 进行诱导, 使其终浓度为0.5mmol/L, 同时以3~ 4ml/min 的流速滴加补料液, 补料体积为500ml。

5: 分析检测。

菌密度的测定; 葡萄糖的测定;周质蛋白的提取; 蛋白的定量; 生物量的测定
6:hGH的纯化和纯度鉴定。

hGH 多克隆抗体的制备及纯化; 抗体亲和层析柱的制备; 抗体亲和层析纯化hGH; 纯度鉴定; 相对分子质量测定; 免疫活性检测
参考文献：
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