研究海马神经元谷氨酸损伤

研究海马神经元谷氨酸损伤

摘要：目的：本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后，细胞活力变化及细胞损伤的方式，初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法：通过MTT，观察不同浓度( μM、125 μM、250 μM、500 μM)的谷氨酸损伤后不同时间（6 h、12 h、18 h、24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过TUNEL、Hoechst染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率，分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果：MTT 结果显示，谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，在所观察的剂量范围内，随着谷氨酸浓度的增加，作用逐步增强，至500 μM达峰值，随着损伤后孵育时间的延长，海马神经元活力逐渐下降。TUNEL和Hoechst染色结果也显示，125 μM谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，主要引起海马神经元的凋亡。结论：谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量（125 μM）谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。关键词：谷氨酸海马神经元 TUNEL

脑卒中以高死亡率和高致残率严重威胁着人类的健康和社会劳动能力。在脑缺血过程中，各种神经递质发生一系列变化，如脑内氨基酸类神经递质大量增加，特别是缺血中心区域。兴奋性氨基酸如谷氨酸(glutamate, Glu)和天冬氨酸(aspartic, Asp )的过量释放是缺血性脑损伤的重要病理机制。据报道谷氨酸受体拮抗剂对脑缺血损伤有很好的保护作用。同样，抑制性氨基酸对脑缺血有保护作用，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性。很多学者认为，兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的平衡失调是缺血性脑损伤的原因之一。

海马是边缘系统的重要组成部分，在学习、记忆、情绪反应及植物性神经功能等方面有重要作用，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一，在结构上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特点。海马是神经元高度集中的部位，锥体神经元是海马区的主要成分，体外培养的海马神经元，对许多致病因素和化学损害较为敏感，因此在研究神经系统疾病的病理机制及治疗方法中均以海马作为病理模型，如缺血/缺氧、癫痫、衰老和兴奋性毒素等均可引海马的特异性损害。在脑缺血模型中，海马神经元最早出现较严重的损害，并且海马缺血性损害和兴奋性神经毒有关，这可能和海马神经元含有高密度的谷氨酸能受体有关。

本研究采用胎鼠海马神经元的无血清体外培养，获得高纯度的神经元。通过高分子量神经丝蛋白（neurofilament high molecular weight，NF-H）和神

经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）染色，鉴定海马神经元的纯度；通过相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响；通过MTT检测在不同浓度谷氨酸损伤后，不同时间海马神经元存活率；同时通过TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP

nick-end-labeling），Hoe-chst比较损伤组和正常培养组凋亡率，探讨谷氨酸对海马神经元的损伤机制，为筛选抗谷氨酸兴奋毒性药物提供实验模型。

1 材料和方法

材料动物：采用健康孕18～19天Sprague-Dawley (SD)大鼠，由南通大学实验动物中心提供；抗体：抗GFAP、NF-H抗体购自Sigma公司；其他试剂和材料：Neuronbasal培养基、B27、DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶、Hoechst33342购自Sigma公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司。

方法

海马神经元的原代培养孕18～19天SD大鼠复合麻醉剂麻醉，无菌条件下取胎鼠脑，置于解剖液中，解剖显微镜下仔细去除脑膜，取出双侧海马，于%的胰酶37 ℃消化10 min，用完全培养基（90%DMEM+10%FBS）终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度大约为106/ml，接种于事先用多聚赖氨酸包被的24孔/96孔细胞培养板。4 h后换成无血清的神经元培养基（98％ neurobasal medium＋2％B27）置5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱培养7～8天。3天半换液。

免疫细胞化学海马神经元按上法培养7天后，吸去培养液，用PBS洗涤一次，加入4%多聚甲醛500 μl，室温下固定30 min，去除固定液，用PBS室温下洗涤10 min×3次。用含10%羊血清、% Triton X-100 的PBS液在37℃条件下封闭60 min，吸去封闭液。滴加一抗（rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，1∶200，rabbit anti-GFAP polyclonal antibody，1∶300），4℃放置过夜，PBS洗。滴加二抗（FITC goat anti-rabbit IgG，1∶200），室温、避光放置2 h，PBS洗。以Hoechst（5 μg/ml）标记细胞核，PBS洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以PBS代替rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光细胞化学检测结果。随机计数500个细胞，计算NF-H阳性细胞百分率。Hoechst 33342染色检测细胞凋亡时，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗细胞两遍，各组加入Hoechst 33342染液（5 μg/ml）室温染色10 min，在倒置荧光显微镜下观察各组凋亡细胞数。每组设3个复孔，每孔随机取五个视野，实验重复3次。

海马神经元谷氨酸损伤处理海马神经元按上法培养7～8天后，吸出原来的培养基，用Locke’s液洗涤细胞3次，每次5 min。以Locke’s 液配制125 μM谷氨酸，其中添加1 μM甘氨酸。正常对照组（Locke’s不含

有125 μM谷氨酸）和实验组均作用15 min，撤除，再用Locke’s液洗涤细胞

3次，每次5 min。重新加入原来的培养基，继续培养。

MTT检测海马神经元以1×106个/ml接种细胞于96孔培养板中，每孔 ml。5%CO2培养箱中培养7～8天。加入谷氨酸损伤，分别于损伤后12 h、18 h、24 h。每孔加10 μl MTT（5 mg/ml）放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养

4 h。然后每孔加入100 μl 20% SDS ，培养箱中培养20

h。酶标仪上570 nm(参考波长490 nm)处测定OD值。每个实验组设8个复孔，实验重复3次。

TUNEL法检测细胞凋亡海马神经元在24孔板上按上法培养7～8天。实验分2个实验组进行，损伤组用125 μM谷氨酸按上述损伤方法处理。谷氨酸处理后18 h吸去培养液，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，室温下用新鲜PBS洗细胞两遍。再用%Triton X-100通透细胞5 min。每孔加入100 μl Equilibrate Buffer，室温下作用5～10 min。然后每孔加入45 μl Equilibrate Buffer，1 μl rTDT，5 μl dNTP，1 μl rTDT酶，避光，37 ℃孵育60 min。加入2×SSC作用15分钟，终止反应。并且在室温下，用新鲜PBS 。最后加入

μg/ml PI染液，染色10 min。用纯水洗。采用共聚焦显微镜观察，计数。每组设3个复孔，每孔随机取5个视野，实验重复3次。

2 结果

海马神经元的培养倒置显微镜下观察，海马神经元分离培养不久后即贴壁，胞体表面光洁，呈锥形或椭圆形，有均匀一致的反光，且折光性明显（图1A，B）。

免疫荧光细胞化学染色用无血清的神经元培养基（98％neurobasal medium＋2％B27）培养7～8天，免疫荧光细胞化学染色可以看到

NF-H阳性细胞占绝大多数，GFAP阳性占%，培养的海马神经元纯度达%以上。可以用于后续实验。结果见图2。

不同浓度谷氨酸对海马神经元的兴奋性毒性海马神经元培养

7～8天后，用不同浓度的谷氨酸损伤神经元，24 h后采用MTT法观察各组细胞活力，结果显示：与正常对照组相比，随着谷氨酸浓度的增加，海马神经元活力显著下降，呈剂量依赖性(图3A)（P均<）。加入125 μM谷氨酸损伤神经元，分别在损伤后6 h、12 h、8 h、24 h后采用MTT，观察各组细胞活力，结果表明，随着损伤时间的延长，海马神经元活力逐渐下降(图3B)。

125 μM谷氨酸损伤海马神经元后细胞形态学变化倒置显微镜