第二章 微生物菌种选育
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
【生物科技公司】第二章微生物菌种选育（笔记类）
【⽣物科技公司】第⼆章微⽣物菌种选育（笔记类）（⽣物科技⾏业）第⼆章微⽣物菌种选育(笔记类)第⼆章⼯业微⽣物基础●知识要点和教学要求1）、了解微⽣物的特点2）、了解常见的⼯业微⽣物3）、掌握⼯业微⽣物菌种的分离和选育4）、掌握⼯业微⽣物菌种的改良5）、掌握⼯业微⽣物菌种的保藏6）、掌握⼯业微⽣物菌种的扩⼤培养●能⼒培养要求通过本章节的学习，学⽣能掌握⼯业微⽣物菌种的分离和选育、改良和保藏⽅法，以及菌种扩⼤培养的基本⼯艺。
●教案内容2.1微⽣物的特点（1）种类多，分布⼴⽬前已发现的微⽣物在10万种以上。
不同种类的微⽣物具有不同的代谢⽅式，能分解各式各样的有机物质和⽆机物质，当前国内外积极利⽤微⽣物来防治公害，分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。
另⼀⽅⾯，不同微⽣物在⽣化过程中积累不同的代谢产物，所以发酵⼯业上常利⽤各种微⽣物来⽣产各种产品，如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗⽣素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维⽣素、菌体蛋⽩、医药产品和化⼯产品等到。
（2）⾼⾯积-体积⽐，代谢能⼒强（3）⽣长迅速，繁殖快（4）适应性强，容易培养（5）易变性2.2常见的⼯业微⽣物⼴义的微⽣物包括病毒、⽴克次⽒体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原⽣动物和⽀原体等。
在发酵⼯业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌⽣长的噬菌体。
微⽣物⼯业的范围微⽣物⼯业越来越深地同国民经济各部门发⽣关系，涉及的范围⼗分⼴泛，⽽且越来越⼤，⼤致可分为下列14类：（1）酿酒⼯业（啤酒、葡萄酒、⽩酒等）（2）⾷品⼯业（酱、酱油、⾷醋、腐乳、⾯包、酸乳等）（3）有机溶剂发酵⼯业（酒精、丙酮、丁醇等）（4）抗⽣素发酵⼯业（青霉素、链霉素、⼟霉素等）（5）酶制剂发酵⼯业（柠檬酸、葡萄糖酸等）（6）酶制剂发酵⼯业（淀粉酶、蛋⽩酶等）（7）氨基酸发酵⼯业（⾕氨酸、赖氨酸等）（8）核苷酸类物质发酵⼯业肌苷酸、肌苷等）（9）维⽣素发酵⼯业（维⽣素B2、维⽣素B12等）（10）⽣理活性物质发酵⼯业（激素、⾚霉素等）（11）微⽣物菌体蛋⽩发酵⼯业（酵母、单细胞蛋⽩等）（12）微⽣物环境净化⼯业（利⽤微⽣物处理废⽔、污⽔等）（13）⽣物能⼯业（沼⽓、纤维素等天然原料发酵⽣产酒精、⼄烯等能源物质）（14）微⽣物冶⾦⼯业（利⽤微⽣物探矿、冶⾦、⽯油脱硫等）2.3⼯业微⽣物菌种的分离和选育2.3.1微⽣物菌种的分离从⾃然界分离新菌种⼀般包括以下⼏个步骤；采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等⼏个步骤。
微生物的菌种选育
理想的工业发酵菌种应符合以下要求：⑴遗传性状稳定⑵生长速度快，不易被噬菌体等污染⑶目标产物的产量尽可能接近理论转化率⑷目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离⑸尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并且有利于产物分离⑹培养基成分简单、来源广、价格低廉⑺对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感⑻对溶氧的要求低，便于培养以及降低能耗一、从自然界获得新菌种的步骤分离微生物新种的具体步骤大体可分为采样、增殖、纯化、性能测定。
采样菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园数根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。
豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。
各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物以及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。
增殖才采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。
纯化常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为两个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。
另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。
具体操作方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微镜操作装置进行单细胞挑取。
性能测定菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。
二、基因突变和微生物菌种选育基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，每个基因约有1000个碱基对。
基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是指DNA序列）。
（生物工程）微生物菌种选育实验
微生物菌种选育一、实验目的1．了解诱变育种的基本原理。
2．学习用诱变育种筛选高产菌株的基本方法。
二、实验内容：1、蛋白酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育2、淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育三、实验原理自然界中分离所得的野生菌株其发酵活力一般很低，必须经过人工选育得到突变株，或通过细胞或基因工程操作成为工程菌后才能用于工业化生产。
突变可自发产生，也可诱发产生，但自发突变的频率往往很低，而诱发突变可大大提高突变频率。
所谓诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使其突变频率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。
诱变可由化学或物理因素引起，其中紫外线是一种最简单、最常用的物理诱变剂，它能使DNA 链中两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体而影响DNA的正常复制，从而造成基因突变。
诱变育种时应遵循以下几个原则：(1)选择简便有效的诱变剂；(2)挑选优良的出发菌株，如生产中选育过的自然变异菌株，或是有利性状多的菌株；(3)处理单孢子或单细胞悬液，以使诱变剂接触均匀，避免长出不纯菌落；(4)选用合适生理状态的细胞，细菌一般以对数期为好，孢子以稍加萌发后为好；(5)选用合适的诱变剂量，凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量就是最适剂量，对质量性状的诱变拟采用高致死剂量(95％~99％的致死率)，而对产量性状，一般认为正变常出现在偏低剂量(75％~80％的致死率)中；(6)利用复合处理的协同效应，两种或多种诱变剂先后或同时使用，或同一种诱变剂重复使用；(7)设计和采用高效筛选方案；(8)创造和利用形态、生理与产量间的相关指标，以提高筛选效率。
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。
一般用于诱变育种的物理因子有快种子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80％左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。
第二章：+微生物工程菌种的来源、选育及保...
出发菌株
（2）制备待处理的菌悬液
保证诱变剂与每个细胞或孢子机会 均等并充分地接触诱变剂，避免细胞团 中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不 纯的菌落。
（3）诱变处理
诱变剂的选择：通常是根据经验来选择恰当的诱
变剂，对于已有诱变处理背景的菌株，变换使用其 他诱变剂也许会得到较好的效果。
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点： 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属 或小杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
三、食品酶制剂生产有关的微生物
四、诱变育种
用各种物理、化学诱变剂处理微生物，提高基因突变频率， 然后再通过适当的筛选方法，获得所需要的优良菌种的育 种方法。
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。
从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种
时间 发酵单位(u/ml)
1943 1943 1943 1945 1947 1955 1971 1977 目前
DSMZ
德国，柏林
UKNCC
英国，伦敦
KCTC NCTC
韩国，首尔 英国，伦敦
中国菌种保藏单位
缩写
ACCC
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中 心
缩写
ISF
名称
中国农业科学院土壤肥料研究所
SH
IA CCGM C
上海市农业科学院食用菌研究所
中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心
CACC
《微生物的菌种选育》课件
诱变育种
总结词
诱变育种是一种通过使用物理、化学或生物诱变剂，诱发微生物发生基因突变，从而获得所需性状的育种方法。
详细描述
诱变育种通常需要处理少量材料，因为诱变剂可以直接诱发基因突变。该方法效率较高，可以快速获得所需的突 变体。常用的物理、化学诱变剂包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。生物诱变剂则包括某些细菌或病毒等。
培养条件控制
法规与伦理问题
微生物的生长和代谢受到培养条件的影响 ，如温度、pH、氧气浓度等，这些条件的 细微变化可能导致实验结果的波动。
在某些应用领域，如药物和食品工业，微 生物菌种选育可能面临严格的法规和伦理 要求，需要遵循相关规定和标准。
未来的发展方向
高通量筛选技术 随着高通量筛选技术的发展，未 来可以更快地筛选到具有优良性 状的微生物菌种，提高选育效率 和成功率。
基因组编辑技术
总结词
基因组编辑技术是一种通过精确地编辑微生物的基因组序列，从而获得所需性状的育种方法。
详细描述
基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9等基因编辑技术，可以精确地编辑和修改微生物的基因组序列，从 而获得具有优良性状的菌株。该方法需要一定的基因组编辑技术基础，但具有高效率和精确性等优点 。
在医药领域的应用
抗生素生产
许多抗生素是由微生物产生的，通过 菌种选育可以获得高产抗生素的菌株 ，用于治疗各种疾病。
疫苗生产
疫苗的生产也需要用到菌种选育技术 ，通过选育具有特定抗原性的菌株， 可以生产出预防各种疾病的疫苗。
在环境保护中的应用
生物治理
通过菌种选育可以获得具有高效降解能力的 菌株，用于处理各种环境污染，如废水处理 、土壤修复等。例如，通过选育能够降解有 机污染物的细菌和真菌，可以有效治理水体 和土壤污染。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
(推荐)《微生物的菌种选育》PPT课件
超带的某些特点，
如抗药性初步判断。
特定的质粒提取方
法和后处理使染色
体和RNA均被除掉。
26
质粒的主要功能
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的； 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能， 从而使宿主得到生长优势。
27
4. 质粒的主要类型
37
（4）Ti质粒（tumor inducing plasmid）
即诱癌质粒或冠瘿质粒（crown gall plasmid）。
Ti质粒是一种200kb的环状质粒，包括毒性区（vir）、 接合转移（con）、复制起始区（ori）和T-DNA区4部分。
T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中， Ti质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。
7
S型
R型
（1）动物实验
S型，著致名病菌的，肺炎球菌转化R型试，验非致病菌，
具荚膜，菌落表面光滑（smoth）无荚膜，菌落表面粗糙（rough）
加热灭菌
热死S菌＋活R菌
8
9
（2）细菌培养试验
10
（3）S型菌的无细胞抽提液试验
11
Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验 12
（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质， 荚膜多糖等） （2）对各组分进行转化试验
严紧型复制控制（stringent replication control）
质粒的复制与核染色体的复制同步， 在这类细胞中，一般只含1～2个质粒；
松弛型复制控制（relaxed replication control）
另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步， 在这类细胞中，一般含10～15个或更多质粒。
第二章-菌种选育、保藏与复壮
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
微生物菌种的选育方法(两篇)2024
引言：微生物菌种的选育是一项重要的研究领域，其在农业、医药、环境保护等多个领域具有广泛的应用价值。
本文结合相关研究成果，探讨了微生物菌种选育的方法，旨在为相关领域的科研工作者提供参考。
概述：微生物菌种的选育是指通过对微生物的筛选和培养，选择出具有特殊功能或者优良特性的微生物菌株。
其方法包括了菌种筛选、培养条件优化等多个环节。
本文将以此为主线，结合实际案例，详细阐述微生物菌种选育的方法。
正文内容：1. 菌种筛选1.1 传统筛选方法传统筛选方法包括菌落形态观察、生理生化指标检测、抗性测定等。
通过对菌落形态和生理生化特性的观察，可以初步确定菌株的特性。
同时，通过对菌株的抗性测定，可以筛选出具有耐药或者耐环境逆境特性的菌株。
1.2 分子生物学方法分子生物学方法可以应用PCR等技术，快速检测目标菌株的特定基因或者特性。
这些特定基因可能与目标菌株的优良性状相关，通过筛选出含有这些特定基因的菌株，可以更加精确地进行微生物菌种的选育。
2. 菌种培养条件优化2.1 培养基配方优化培养基是微生物菌种培养的基础，其配方的优化对于菌种的生长和代谢具有重要影响。
通过调整培养基中的碳源、氮源、矿质元素等成分，可以优化菌株的生长条件。
2.2 培养条件控制培养条件的控制对于微生物菌株的生长和产生特定代谢产物等方面具有重要影响。
温度、pH值、培养时间等因素的调控，可以使菌株在适宜的环境中进行生长和代谢，从而保证其优良特性的表达。
3. 菌株遗传改良3.1 重组DNA技术重组DNA技术可以通过将目标基因导入到菌株中，使其具有特定的功能特性。
通过引入外源基因，可以使菌株产生特定的代谢产物，或者具有特定的酶活性等特性。
3.2 融合技术融合技术是指将两个或者多个菌株进行融合，从而形成新的菌株。
融合后的菌株可能具有不同菌株的优点，如抗性能力、代谢能力等，从而提高菌株的综合性能。
4. 菌株功能验证4.1 体外实验通过在实验室中建立靶点验证体系，对选育出的菌株进行功能验证。
第二节 工业微生物菌种选育
1.选择出发菌株
• 出发菌株是指用于诱变的原始菌种。 • 选择原则：菌种对诱变剂的敏感性强、变 异幅度大、产量高。 • 获得途径： （1）从自然界的土样或水样中分离出来的野 生型菌种； （2）生产中正在使用的菌种； （3）从菌种保藏机构购买
2.同步培养
• 培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们 的生理状态和代谢活动也不完全一样。 • 同步培养法：使培养的微生物比较一致， 生长发育在同一阶段上的培养方法。 • 在诱变育种前，最好选用生理状态一致的 单细胞或单孢界直接分离筛选菌种的步骤
• 1.采样： （1）选择采样地点 中性偏碱：细菌和放线菌多 酸性红土壤及森林土壤：霉菌多 果园、菜园、野果生长区（富含碳水化合物）和沼泽池：酵母和霉 菌多。 （2）确定采样时间 秋初好：温度适中，雨量不多。 夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后显著减少。 （3）采样 5cm~15cm处取土。放在牛皮纸袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，标明 样品种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等 采集的样品应及时处理，暂不处理应放在4℃保存。
机械法 （选择法） 离心沉降分离法
同步培养方法 诱导法 温度调整法
膜洗脱法
营养条件调整法
特点：同步生长只能维持几代
机械法
膜洗脱法
通过大小不同 的微孔过滤器
离心沉降分离法
小细胞 沉淀慢
• 主要通过控制环境条件：如温度、营养物质等来诱导同步生 长。 • （1）温度调整法 • 将温度控制在接近最适温度条件下一段时间，缓慢进行新陈 代谢，但不进行分裂。然后再将温度提高到最适生长温度， 大多数细胞进行同步分裂。 • （2）营养条件调整法 • 控制培养基的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限 制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续 生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基 中，它们便进入了同步生长。 • 另外有在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质（如氯霉 素）诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用 紫外线处理；对光合行微生物的菌体可采用光照与黑暗交替 处理法等。 • 总之：不管采用哪种诱导因子，都必须具有以下特性：不影 响生物的生长，但可特异性地抑制细胞分裂，当移去（或消 除）该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。
菌种的选育
土曲霉 土曲霉 链霉菌
金色链霉菌
35.9
54
5、后培养
表型迟延现象
生理性
分离性
遗传物质经诱变处理后发生的突变，必
须经复制才能养才能稳定
变异，使菌株表现出高的突变频率。
55
6、变异菌株的筛选
由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，
必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。
5
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透
明圈法初筛. 在选择培养基中加入碳 酸 钙 ，使平板呈混浊
状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成 清晰的透明圈.
6
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在 深 层 培 养 中 的 产 酶 单 位 与 平 板 上
圈的大小之间并不完全成正比。
24
4、自然选育的特点
自然选育简单 易行，可以达 到纯化菌种、 防止菌种衰退、 稳定生产、提 高产量等目的。
自然选育的最 大缺点是效率 低、进展慢， 很难使生产水 平大幅度提高。
25
用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质
（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过
筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
基因突变
29
光复活作用
切补修复
损伤修复
重组修复 SOS修复系统 DNA多聚酶的校正作用
30
前 突 变 ——诱 变 剂 所 造 成 D N A 分 子 的 某 一 位
臵的结构改变。
31
光复活作用
具有校正差错 切补修复 的性质，不利于 突变的诱发。
DNA多聚酶校正 作用
32
重组修复
具有引起差错的 性质，利于突变
徐莹生物工艺学-第章菌种选育
2020/5/28 菌种保藏及作为中国进海洋一大步学 食育品学种院的出发菌株
23
生物工艺学 徐莹
问题：
如何使样品中所含目标微生物的可能性大？ 如何在后续的操作中使这种可能性实现？
2020/5/28
中国海洋大学 食品学院
24
生物工艺学 徐莹
（一）采样 1）从大自然中的原材料采样原则： 根据筛选的目的，微生物的分布概况 及菌种的主要特征与外界环境关系等，进 行综合地、具体地分析来决定。
的土，酵母菌较多。
d. 采土的最适季节。一般应避免雨季采土，而以秋季采 土比较理想。
e. 土壤的酸碱度。 细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多； 酵母菌和霉菌，一般在偏酸性的土壤、普通植物花 朵、瓜果种子及腐植物等上面较多。
②结合产品的特点
采样时要注意的问题
• 如：耐高渗透压→蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮
释液经过80℃，10min水浴处理。
•营养体：60-70℃ 10min 杀死； •芽孢：耐100℃以上高温。
芽孢
4）添加抑制剂
• 某些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制 作用。注意对象、浓度。
– 分离细菌时，加入50U/ml制霉菌素，抑制霉菌和酵 母菌
2020/5/28
中国海洋大学 食品学院
19
生物工艺学 徐莹
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗
污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定
4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
2020/5/28
中国海洋大学 食品学院
显微操作仪，专业程度高
2020/5/28
第二章工业微生物及其培养
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 →80度30分钟处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 采样（造纸厂） 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变。 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
XXX
XX
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XX X
X
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XX X
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X
Repeat for multiple cycles
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
项目 进化速度 进化对象 进化 周期 影响对象 突变效率
常规定 向进化
缓慢进化
整个基因组
多年 完整基因组
低
特定基因/ DNA 几天 部分基因组 快速进化 操纵子/病毒 Shuffling
产氨短杆菌
它是氨基酸、 核苷酸工业 生产中常用 的菌种，也 是生产辅酶 A的菌种。
（四）放线菌
因菌落呈放射状而得名。 放线菌最大的价值在于能 产生各种抗生素。能产生 许多抗生素的链霉菌属 (Streptomyces)，为放线菌 的代名词。
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• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
• 藻类中隶属原核微生物的蓝绿藻是最早的光合放氧生物， 对地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境起了巨大的作 用。有不少蓝藻（如鱼腥藻）可以直接固定大气中的氮， 以提高土壤肥力，使作物增产。还有的蓝藻为人们的食品， 如著名的发菜和普通念珠藻（地木耳）、螺旋藻等。 • 用藻类将CO2转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得 石油，可占细胞干重的5%～50%，合成的油与重油相同， 加工后可转变成汽油、煤油和其他产品。
主要涉及种： 黑根霉、华根霉、 米根霉
3、工业上常用的霉菌
——毛霉属（Mucor）
毛霉的主要用途： 腐乳、酱油、豆豉，转化甾族化合物
4、放线菌
• 是一类G+菌、单细胞、丝状多核分支的、以孢子形式繁 殖的、陆生性很强的原核微生物。
显微镜下的放线菌
放线菌菌落形态
用于生产抗生素的放线菌
5、担子菌（basidiomycetes）
• 诱变程序：
【诱变】 出发菌株选择：野生型菌株；经历过生产条件考验的菌株 处理菌悬液的制备：对数生长期、菌悬液的均一性、选择孢子或单倍体细胞 避免表型延迟现象 诱变剂选择：诱变剂的致死量；诱变剂复合处理 【筛选】 筛选方案的确定：初筛和复筛；营养缺陷突变株、抗反馈阻遏和抗反馈 抑制突变株、组成型突变株、抗性突变株等 突变基因的表现：表型延迟现象（phenotypic lag）就是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。往往 是由于对数期细胞是多核或多倍体而造成的。隐性基因在杂合体上的出现以 及菌体内原有酶系的存在是表型延迟的两大原因。 克服表型延迟的方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时， 以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样， 隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分 离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌 落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
一、蒸馏水悬浮法：最简单的保藏方法，将菌种悬浮于
无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏，可用于好气 性细菌和酵母等。
二、传代保藏：将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然
后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。最好 在基本培养基上传代，以低接种量来淘汰突变株，低温 （5℃）来防止脱水降低代谢活力。此法最为简单和经济， 且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、 菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。 可用于实验室中若干菌种的保藏，一般不适宜作工业生产 菌种的长期保藏方法。此方法一般保存时间为3～6个月。
酱豆
曲霉的主要用途： 食用色素 生产糖化饲料 有机酸、酶制剂是做酱、酿酒、制醋的主要菌种 主要涉及种： 米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉
3、工业上常用的霉菌
——青霉属（Penicillium）
青霉的主要用途： 青霉素 葡萄糖酸
3、工业上常用的霉菌
——根霉属（Rhizopus）
根霉的主要用途：
米酒、黄酒
淀粉糖化菌 有机酸 甾体转化
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏 菌种退化 菌种复壮 菌种保藏
一、菌种退化
• 通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理状态和形态特 征逐渐减退或消失的现象。 （一）在生产中菌种退化的表现：菌种的发酵力(如糖、氮的消耗)下降、 繁殖力(如孢子的产生)下降、发酵产品的得率降低等。 （二）菌种退化的原因 1.菌种保藏不妥。 2.连续传代，或经诱变得来的新菌株发生回复突变，发生基因突变。 3.菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到某些不利条件，或是失 去某些需要的条件。 4.菌种混杂。在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致 原有的性状丢失。 （三）防止退化的措施 第一，合理育种，避免使用多核细胞，诱变后经培养及分离纯化再保存 第二，做好菌种的保藏工作，使菌种的优良特性得以保存。 第三，应该满足其生长的要求。 第四，尽量减少传代次数。 第五，防止菌种混杂，定期纯化菌种。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
概述发酵工程菌
来源：自然界（如土壤、 水和空气，以土壤最多） 特点： 培养基原料廉价 发展趋势：野生菌→诱发基因 突变的变异菌→基因重组的定 向育种和代谢控制育种
生长条件易于控制，生长迅速，产量高，酶活高
• • • • • • 1、细菌 2、酵母菌 3、霉菌 4、放线菌 5、担子菌 6、藻类
1、细菌类
2、酵母菌
——酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
酿酒酵母的应用： 传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母片以及制 造面包等，所以又称为酿酒酵母
近年来，提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。由 于酵母菌体内的维生素、蛋白质含量较高，食用安全，所以啤酒酵 母作为一种单细胞蛋白(SCP)可作食用、药用和饲料用酵母。它的转 化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。在维生素的微生物法测定 中，啤酒酵母常被用于测定生物素、泛酸、硫胺素、肌醇等的含量。
2、酵母菌
——假丝酵母（Candida）
热带假丝酵母
白色假丝酵母
几种酵母的菌落形态
用途：假丝酵母的蛋白质和维生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素 和硝酸盐作氮源，在培养基中不加其它因子即可生长。它能利用造纸 工业中的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉和木材水解液等。 因此能利用假丝酵母来处理工业和农副产品加工业的废弃物，生产可 食用的蛋白质，在综合利用中很有价值。此属中有的菌能转化50％的 糖成为甘油。 假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂。
采用涂布法和影印平 板法，取分离的单菌 落进行鉴定和小型发 酵试验
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育
自然选育 诱变育种 杂交育种 原生质体融合 基因工程育种
• 第三节 菌种的退化和菌种保藏
1、诱变育种
• 定义：诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的 微生物细胞群，促使其突变率大幅提高，然后采用简便、 快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突 变株用于生产和研究。诱变育种除能提高产量外，还可达 到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺的目的，该方 法简单、快速、收效显著仍被广泛采用。 • 原理：染色体畸变和基因突变两大类。 • 诱变剂：能够提高生物突变频率，扩大变异幅度的物质。 包括物理、化学诱变剂及生物诱变因子。 物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射线、快中子。 使用最方便且安全的是紫外线。 化学诱变剂：碱基类似物、与碱基反应的物质。使用最多、 最有效的是烷化剂。 生物诱变剂：噬菌体、转座子。
二、菌种复壮
• 狭义的菌种复壮：指菌种发生衰退后，通过纯种分离和 性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个 体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。 • 广义的菌种复壮：是一种积极的措施。指的是菌种在生 产性能尚未发生衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生 产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高。 • 菌种复壮的方法： 1.纯种分离。淘汰已衰退的个体。 2.通过寄主体进行复壮。淘汰已衰退的个体。 3.联合复壮。高剂量UV和低剂量的亚硝基胍（NTG）联 合处理。
2、杂交育种
• 定义：一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核 微生物的接合、F因子转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性 状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。 • 程序：选择原始亲本→诱导筛选直接亲本→直接亲本之间亲和力鉴定 →杂交→分离到基本培养基或选择性培养基→筛选重组体→重组体分 析鉴定。
左图：蓝宝石能源公司 （Sapphire Energy）计 划于2014年在美国-墨西 哥边境以北靠近新墨西 哥的哥伦布小镇建造一 座300英亩的藻场，进行 大规模示范并制造藻油 （algae oils）。
二、工业微生物的来源
各菌种保藏机构 和大型发酵工厂 的菌种 微生物菌种的广 泛来源。在特定 的生境下可以分 离到有特殊能力 的微生物菌株