利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体

第34卷第4期 2016年12月

四川农业大学学报

Journal of Sichuan Agricultural University

Vol.34 No.4

Dec. 2016

doi：10. 16036/j. issn. 1000-2650. 2016. 04. 002

利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定

小麦背景中的黑麦染色体

刘洪坤1，唐宗祥2*

(1.南充职业技术学院，四川南充637000;2.四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室，成都611130)

摘要：【目的】通过荧光原位杂交(FISH)技术能有效地检测小麦背景中的黑麦染色体，进一步发现利用寡核苷酸探针 和非变性FISH(ND-FISH)技术可以提高黑麦染色体的检测效率。【方法】通过借助SLAF-seq(specificlengthamplified fragment sequencing)和生物信息学方法开发寡核苷酸探针。【结果】开发了 3种新的寡核苷酸探针Oligo-2874、Oligo-5296和Oligo-9965，它们可用于ND-FISH分析。通过与小麦背景中的黑麦染色体端部和亚端部特异杂交，从 而达到识别黑麦染色体的目的。【结论】这些寡核苷酸探针可以用于快速高效地鉴定小麦背景中的黑麦染色体，丰富 了小麦-黑麦杂交后代FISH分析的探针源。研究结果也表明SLAF-seq技术可以用来开发小麦近缘种属特异的重 复序列FISH分析探针。

关键词院小麦；黑麦；寡核苷酸探针；非变性FISH; SLAF-seq

中图分类号:S512.5 文献标志码：A 文章编号= 1000-2650(2016)04-0402-04

Development of Novel Oligonucleotide Probes for Identifying Rye

Chromosomes in Wheat Background

LIU Hong-kun1,TANG Zong-xiang2*

(1. Nanchong Vocational and Technical College, Nanchong 637000, Sichuan, China; 2. Province Key Laboratory of

Plant Breeding and Genetics, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

Abstract:【Objective】Fluorescenceinsituhybridization(FISH)technologycanbeusedtoidentifyrye chromosomes effectively in wheat backgrounds.Oligonucleotide probes and non-denaturing FISH(ND- FISH)can increase the efficiency of detecting rye chromosomes.【Method】In this study，SLAF-seq (specific length amplified fragment sequencing)and bioinformatics methods were used to develop novel oligonucleotide probes.【Results】Three novel oligonucleotide probes Oligo-2874?Oligo-5296 and Oligo- 9965 were developed and they can be used for ND-FISH assays.The three probes only hybridize to telomeres and sub-telomeres of rye chromosomes.【Conclusion】Therefore?these oligonucleotide probes can discriminate rye chromosomes in wheat backgrounds quickly and efficiently?and they enrich the probe sources for FISH analysis of wheat-rye hybrids.The results also indicate that SLAF-seq can be used to develop specific repetitive DNA probes for FISH analysis of relatives of wheat.

Key words:wheat；rye；oligonucleotideprobe；non-denaturingFISH；SLAF^eq

黑麦在小麦育种中发挥了重要的作用，为小麦 麦1BL/1R S异位染色体在小麦育种中被得到广泛品种改良提供了多种优良基因^，尤其是小麦-黑 的应用[3]。因此为了追踪、鉴定小麦背景中的黑麦染

收稿日期=2016-09-05

基金项目：国家自然科学基金项目（31471498)。

作者简介:刘洪坤，副教授，E-mail: 893146765@。责任作者:唐宗祥，博士，教授，主要从事作物遗传育种研究工作，E-mail: zxtang@。

第4期刘洪坤，等：利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体403

色质，先后发展了 C-带、原位杂交和基于P C R的分 子标记技术，并且都取得了巨大成功。但因C-带技 术的耗时和技术要求高等缺点，限制了其在育种中 的应用[4]。而基于P C R的分子标记虽然操作简便，但 不能反映外源染色体片段的大小，也无法检测小麦- 黑麦染色体之间的易位，荧光原位杂交(fluorescence insituhybridization,FISH)和基因组原位杂交(genomic insituhybridization，GISH)是鉴定和追踪异源染色 质的较理想的技术，已被广泛应用于杂种染色体组 成分析[M1。FISH技术能通过不同的带型来鉴别染色 体'并且最近发展起来的合成寡核苷酸探针成功 地应用于荧光原位杂交，利用此方法分析小麦和黑 麦染色体，具有经济高效的优点[8-9]，同时还可通过 非变性荧光原位杂交(ND-FISH)来进行分析，大大 缩短了杂交时间，提高了材料鉴定的效率[10]。目前，尽管可以利用寡核苷酸探针Oligo-1162、Oligo- pSc200和0ligo-pSc250代替黑麦基因组D N A探 针，通过ND-FISH途径分析小麦-黑麦杂交后代 [10]，但是 0ligo-pSc200 和 0ligo-pSc250 是根据已 知串联重复序列开发的寡核苷酸探针[10]，这在很大 程度上限制了新型寡核苷酸探针的开发。此外，对于 小麦的其他近缘种属，也需要适当的方法来开发这 类寡核苷酸探针。因此本研究借助SLAF-seq(specific lengthamplifiedfragmentsequencing)技术和生物信息学方法，开发了多个新的可以鉴定小麦背景中黑 麦染色体的寡核苷酸探针，并对开发这类寡核苷酸 探针的方法进行了综合讨论分析。

1材料和方法

1.1试验材料

通过利用普通小麦绵阳11与二倍体黑麦Kustro杂交，加倍获得八倍体小黑麦MK(2n=56)。再利用M K根尖中期细胞染色体用于探针验证。所 有试验材料均由四川农业大学植物遗传育种省级 重点实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1检测黑麦染色体的寡核苷酸探针的制备

将黑麦Kustro的基因组DNA进行SLAF测序 (北京百迈克公司），测序程序主要参照ChenS.等[11]描述的试验方法，将黑麦Kustro的基因组DNA用 限制性内切酶HaeIII消化。将测得的数据与小麦A、D基因组和普通小麦中国春的DNA序列(序列下载网址为：/triticum-urartu-progenitor- of-wheat-a-genome/；/，由北京百迈克公司分析)进行比对，获得大量同源性 低的长度为60b p的序列，再利用Perl语言进行数 据编程，对所得序列进行比对和聚类，从中随机选 取重复次数在1200以上的7条序列用于合成寡核 苷酸探针，已将这些寡核苷酸探针列于表1。除表1中列出的新开发寡核苷酸探针外，另一种已报道的 寡核苷酸探针〇他。-1162[10]也用于检测小麦背景中 的黑麦染色体。

1.2.2非变性荧光原位杂交(ND-FISH)

寡核苷酸探针由上海Invitrogen公司合成，在 序列的5忆端添加6-FAM荧光标记，合成的探针用 1xTE(p H7.0)溶解，每个0D值加1X TE100滋L，杂 交时用1x T E稀释10倍，根据探针的不同，稀释的 最终浓度在51.06耀70.37 ng/滋L之间。每张片子用量 0.4耀0.5滋L。杂交液包含探针、2xSSC和1xTE(2xSSC 与1xTE按1:1等量混合)，每张片子加杂交液10滋L，探针和染色体都不需变性处理，盖上盖玻片，在湿 润的保鲜盒中42益杂交1h，2xSSC室温洗脱，再加 人含 DAPI 的抗裡色剂（VectorLaboratories，USA)，最后镜检、照相。根尖细胞中期染色体制备按照

表1合成的用于黑麦染色体检测的寡核苷酸探针序列

Table 1 Sequences of synthesized oligonucleotide probes for detecting rye chromosomes

探针名称

Probe name核苷酸序列(5'-3'),

Nucleotide sequence(5'-3')

每张片子在所测序用量列中的重

Applied 复次数amount for Repeat each slide(ng) number

Oligo-1376 TGGATTGGGTATTCTTCAGAAAAAATAAACTAGGCTCATTTTCACAAAGAAAAAATAGC Oligo-2874 ATACGAACTCCGTTTGGGCTCCATGACCTGCCAAAACGACCGCAGCGAAAATTCGTA Oligo-5296 TGGACAAAACTGTGCATACCAGCTCTTCTACATTGCATTCGTACTGTTTGAAAATAATA Oligo-9965 AACTCTCGCGAAGAAACGGTGATCAAAGAAAATACAAAAATCAACCTAGAGTCCGAATT Oligo-12196 GCTAGTTCAAATCGGTGGGGGGTACTTTTGTAACACACCCTACATTTTGGACAAGCGCG Oligo-14990 CTTCAATTAGCATACTCATGTGAATGTACTTCCTCTTCATGCACAACCAGGGGGGAGGT Oligo-16521 GTGAATGTACTTCGACTTCATGCACAACCAGGGGGAGGCTGTACATCCATACAAACACG 27.52 4 530 27.68 6 270 27.27 6 200 25.53 1 299 28.03 1 890 28.15 1 807 27.35 1 808