微生物多样性的观察

微生物多样性的观察

摘要：微生物在自然界广泛分布，无所不在，无论在万米高空，还是在深海，或是地壳、高原冻土，抑或极地冰芯，火山喷发地区、盐湖、热泉等都能寻找到它们的踪迹；可以这么说，

微生物的生存环境涵盖了地球上的所有生境。为此，了解环境条件与微生物的关系对于理解

微生物世界的多样性尤其重要。

本实验采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基三种培养基对空气、水、土壤等采集到的样本进行观察，了解土壤、水体、空气中微生物的种类、数量和分布差异；了解微生物几大类群（细菌、放线菌、真菌和噬菌体）的多样性，辨识三大类菌群菌落的基本形态特征和差别；了解和掌握一些土壤、水体、空气和植物体微生物采集的常用方法。掌握如何从各种环境中采样、分离筛选和纯化功能性微生物，同时对其功能进行分析和初步了解；掌握功能性微生物的菌种保藏和分类鉴定方法。

关键词：环境微生物分离纯化

1实验原理及材料

1.1

自然环境中的微生物都是混居形式的，并且不同的环境下具有不同的微生物类群和区系，不同的微生物具有不同的营养需求和生长条件，通过不同的培养基和适当的分离方法就可以将以混居形式存在的各种微生物分来开来并得到它们的纯菌株，从而了解这些环境中的微生物类群和数量。分析微生物的数量和种类，首要的一步就是采取微生物的样品。采集微生物样品时，一般应当场做好采样记录，并用照相机拍摄采样点周围环境。采样记录项目应包括采样地点（包括地理位置、海拔高度、向阳程度、雨量、年平均温度和温差等）、日期、人员、样品编号、样品类型、采样深度、环境条件等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。

1.2

1.2.1微生物多样性的表现之一就是其形态结构的多样性。微生物的形态结构特征包括个体形态结构与群体形态结构，个体形态结构主要通过显微镜以及染色技术辨别其形态构造；而群体形态则是通过单个微生物细胞在固体培养基上经生长繁殖后所形成的菌落（子细胞集合）来认识。肉眼观察在固体和液体培养基中培养的细菌菌落和菌苔的大小、形状、光泽、颜色、硬度、色素、生长速度、透明度以及生长状况等特征。采用显微镜观察细菌细胞的形态、大小和特殊的结构（如芽孢、颗粒内含物、荚膜），测定革兰氏染色反应、抗酸反应结果。利用扫描和透射电子显微镜观察细胞壁、鞭毛、纤毛和菌毛等细微结构的特征。

1.2.2革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，该方法是1884 年由丹麦病理学家Christain Gram 创立的。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色（图1-2-1 A、B）。

1.2.3芽孢、荚膜和鞭毛是细菌菌种鉴定的重要指标，在菌落形态上也有其相关特征。芽孢壁很厚且结构致密，着色不易，一般采用碱性染料并且加热和延长染色时间可以使得芽孢着色，通过水洗和复染可是使芽孢细菌染成两种颜色（图1-2-1 C）。荚膜是一种含有多糖和蛋白的胶状粘性物质，结构疏松，与染料的亲和力低，采用负染的方法可将菌体与背景着色而荚膜透明以利观察。

1.3

放线菌与细菌一样，属于原核微生物，但是其形态构造和繁殖方式与细菌具有很大的差别。真菌包括酵母菌、霉菌和蕈菌，为真核微生物，其中酵母菌为单细胞真菌，而霉菌则是丝状真菌的别称。放线菌和霉菌都具有比较发达的分枝菌丝，其中放线菌的菌丝体由伸入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝组成，气生菌丝可进一步分化为孢子丝。孢子丝和孢子的形态与颜色是放线菌分类的重要依据。霉菌在培养基上的生长方式类似放线菌，吸收营养的菌丝伸入于培养基里面，培养基表面以上的菌丝具有不同程度的结构与功能分化，形成子实体并可以产生各种类型的孢子。为了能比较完整的观察到形态比较完整的放线菌和霉菌的形态结构，通常可以采用插片培养法或搭片培养法来解决。当插在培养基中的盖玻片被取出时，沿着玻片两面生长的放线菌或霉菌能较好地反映自然生长状态的形态结构，有利于更好的显微观察。

1.4

噬菌体是细菌病毒的通称，是一类只能在电子显微镜下才能观察到的非细胞分子生物，专性寄生于活的原核微生物细胞内。就噬菌体与宿主细胞的相互关系来说，可以将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，前者在宿主细胞内的繁殖可以导致细胞的完全裂解，而后者在宿主细胞内多以溶源状态存在，只有在受到外界环境因素诱导或低频自发性诱因才会使得宿主细胞发生裂解。由于噬菌体生命属性的特殊，因此研究它们的方法学和前面所述的几类原核微生物和真核微生物都有明显的区别，比如分离方法、培养方法与检测方法等。对噬菌体的研究导致了一批重大的生命科学现象的发现。

2实验方法

2.1 2.1.1 在选好适当地点后，用灭菌小铲子除去表土和地面植被及枯枝落叶，然后用土

壤采样器采取离地表以下5-15cm 处的土约10g，剔除石砾并混合均匀后盛入清洁的信封中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。采样使用ETC 桶式深水采样器采取环境中的水，备用。在约定的时间和地点（室外环境和室内空间各一组）依次打开皿盖在空气中暴露5min。然后合上皿盖并做好标记即可。

称取2克土壤样品，放入盛有18mL 无菌水并带玻璃珠的三角瓶中（玻璃珠的主要作用是打散土壤样品），振摇15min，使得土壤与水充分混合，将微生物细胞均匀分散。静置5min 后，用移液器戴上无菌吸嘴从中吸取0.1mL 土壤悬浮液，加入事先盛有0.9mL无菌水的离心管中并吹吸混匀。然后用换一支无菌吸嘴从此离心管中再吸取0.1mL 加入下一支0.9mL 无菌水的吸管中混匀。按此法类推，制作10-1，10-2，10-3，10-4 等不同稀释度的土壤溶液。取上述稀释土壤样品液各0.1mL，分别加在已经制好的牛肉膏蛋白胨、高氏一号和马铃薯培养基平板上。将以上所有接种有环境样品的培养基平板涂布后，倒置放在合适的温度下进行培养留待下次实验使用。

2.1.2 口腔微生物采集与简单染色观察

1) 先取干净的载玻片一张，在载玻片中央滴上一小滴蒸馏水。

2) 用无菌牙签在口腔内牙缝中反复擦拭几遍，刮下少许牙垢然后将其在水滴中打散并

涂布于载玻片上。

3) 自然干燥后通过酒精灯火焰2~3 次加热固定。

4) 将沙黄染液滴在玻片中央的干燥涂面上，静置染色3~5min，用水将多余的染液洗

掉并用吸水纸把残余的水分吸干，待充分干燥。

5) 在显微镜下按照从低倍到高倍，再到油镜的顺序进行观察。

2.2 2.2.1 菌落的观察。菌落形态特征包括大小、颜色、边缘、质地、表面形貌、湿润或干燥、

光滑或皱褶、是否隆起，是否产生色素、同心圆等。

2.2.21) 制片：在一干净载玻片上的三个区域做上标记（＋、待测、－）。将玻片翻转，

在标记的相应位置各滴加一小滴蒸馏水。用接种环分别挑取一环标准革兰氏阳性（金黄色葡萄球

菌）、革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）斜面或液体培养物，以及实验一细菌分离平板上的单个菌落

的少量菌体（需提前24h 活化培养），分别与上述三个水滴混合，均匀涂开制成一薄层细菌涂面。

自然干燥或将细菌涂片通过酒精灯火焰数次（每次用手背测试玻片，以不烫手为宜），用热空气