酶切体系及PCR体系
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酶切反应体系
1.反应体系尽可能的小。
2.酶切缓冲液为整个体系的十分之一,本实验室内切酶为NEB公司,缓冲液的选择,可参照该公司的使用说明。
3.内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一(若为双酶切,则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一),酶用量过大可能反而不利于酶切(因为内切酶中含有甘油)。4.DNA总量不宜大于2-3ug,否则在进行琼脂糖凝胶电泳时,会产生拖尾现象。
5.一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h,如要酶切回收,应切5-8h,特别是单酶切的载体,一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。
6.一般小样鉴定为20ul总体系(酶一般用0.5ul),酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul,酶切3-4h后,可补加酶1ul)。
7.一般65℃水浴15分钟,灭活内切酶(也可不灭或,因为加入溴酚蓝后酶就失活了)。8.用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。
PCR反应体系
1.反应体系一般为20-25ul
2.摸板:菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul
3.引物:25umol/l 各0.5ul
4.dNTP : 0.5ul
5.10X Buffer: 如含Mgcl2的为总体系的十分之一(2-2.5ul),如不含Mg cl2,应加入Mgcl2溶液1.5ul
6.Taq酶:0.5ul
7.加入Milli Q水,补齐至20-25ul
PCR参数
1.95-96℃3-5 min
2. 95-96℃30-40 Sec
3. (TM-5℃)一般为45-60℃30-40 Sec
4.72℃ 30-180 Sec(一般一分钟为1000个碱基)5.72℃链延伸10 min
6. 10℃保存
以上只用于普通PCR,一般为鉴定用。
KOD-Plus PCR反应体系
1.应体系一般为50ul
2.摸板:菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul 3.引物:25umol/l 各1-1.5ul
3.2 mM dNTP s : 5ul
4.KOD-Plus Buffer: 为总体系的十分之一5ul 5.KOD-Plus酶:1ul
6.25 mM MgSO45ul
7.加入Milli Q水,补齐至50ul
PCR 参数:
变性:94℃2-4 min
94℃15-30 Sec
结合:(TM-5℃),30-40 Sec 延伸:
68℃, 1 min/Kb
68℃, 10 min
保存:10℃30h
以上用于PCR回收基因,或GC含量较高的基因。