五分类血球仪光学原理

一种白细胞光散射信号相关性的消除方法
李迎春
QQ ：52521438
摘要 分析了两种角度的激光散射法测量白细胞的缺陷：散射信号的相关性对细胞分类的影响，提出两种解决方案，并采用其中一种比较简单的方法来减小这一影响，从而提高了仪器的分类准确度。

1 前言
在激光散射与鞘流技术结合的血液细胞分析技术中，通常利用细胞在各个方向的散射光的强度来判断细胞的表面信息（体积大小）和细胞的内部结构（颗粒度、分叶情况以及折射率）。

一般情况下会使用两个角度的散射光来对细胞进行粗略的分类：低角（1~5度）和高角（6~20度）。

其高角度粗测细胞的大小，高角度散射光测量细胞结构以及复杂度的相对指标。

如果是理想情况下，低角度散射光反映细胞的体积信息，高角度反映细胞的内容物信息，但是实际上，对于细胞的内部结构比较复杂的情况下，低角度也携带了大量的细胞内容物信息，也就是低角度与高角度并不是完全独立的，我们称之为光散射信息的相关性。

这种相关性在散点图上表现为朝向原点方向的拖尾。

在血液细胞分析中,如果这种相关性太大,就会造成分类的不准确,从而加大了诊断的误差。

本文试图从散射原理入手，分析这种信号相关性的由来，并采用一种有效的方法来减小这种影响。

2 原理分析
2.1 粒子的散射光强与散射角度的关系
对于分子级别的粒子（尺寸远小于波长, r<0.1um ），其散射强度在0~180度几乎是比较均匀的，服从Rayleigh 散射，其散射光强度与粒子的半径r 和入射光波长的关系如下(不考虑偏振态的情况)：
2
42
22
640
2116d n n r I I λπ⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛+−= （1）
上式中：
r-粒子半径；
n-折射率；
d-粒子到观察点之间的距离；
λ-入射光在真空中的波长；
由公式（1）可以看到，对于Rayleigh散射，散射强度与粒子半径的6次方成正比，与入射光波长的4次方成反比，而与散射角度没有关系，也就是在各个方向的散射光强大小几乎一样。

图 1 细胞散射的均质球模型
对于粒子尺寸在0.1um~2um之间的粒子，用均质球模型的Mie理论可以很好的解释，图2给出了0.1um的粒子散射光强与散射角度的关系。

从图中可以看出，对于比较小的粒子（0.1um），其前向散射光（1~5度）与前向高角度的散射光强度差别不大，也可以认为其散射光在各个方向是均匀的。

图 2 小尺寸（0.1um）的粒子散射光强与散射角度的关系
但是对于比较大的粒子（尺寸为入射波长的数十倍），前向散射光强度就比侧向散射强度大很多倍，这就是为什么前向散射光与细胞体积关系密切的原因。

对于低角度的散射光，粒子的折射率对散射光强的影响并不大，见图3.3。

对于高角度的散射光，折射率对散射光的影响就比较明显了，见图3.4。

因此高角度散射光更多的反映了细胞的内容物信息（折射率信息）。

图3.1 粒子半径较小（0.5um）图3.2 粒子半径较大（10um）
图3.3 10um粒子的前向小角度散射图3.4 10um粒子的前向高角度散射
图 3 不同尺寸、折射率下散射强度与散射角度的关系
2.2 细胞内部颗粒对散射信号的影响
以上的分析是均质球的MIE理论基础之上的，实际上对于血液细胞，不同种类不仅内部折射率不同，而且会有颗粒存在（如嗜酸性粒细胞，中性性粒细胞，嗜碱性粒细胞）,图4为内部带有颗粒的一个细胞模型。

细胞内部颗粒的存在会对不同角度的散射光的分布产生一定的影响。

与细胞的尺寸相比细胞内部的颗粒尺寸是很小的，对于这些颗粒的光散射可以用Rayleigh散射理论或者用MIE 理论来描述，最终结论都一致：即对于细胞内部的颗粒在各个方向的散射是比较均匀的，散射角度的变化对散射光强的影响并不明显。

图 4 细胞内部颗粒对低角度散射信号的影响
图4种，假设细胞内部存在两个颗粒1和2，那么在这些颗粒上也会发生二级散射、多级散射。

细胞中的颗粒排列不是一条直线而是无序的，图4中颗粒1的散射光有一部分成为颗粒2的入射光，而这部分入射光在颗粒2上也会产生全方位的散射光，也就是有一部分对颗粒2来说是高角度（反映内容物信息）的散射光会被低角散射光（反映体积信息）收集系统所收集，这样总体来说，低角度散射光中就包含了很多细胞的颗粒度信息，而且细胞中颗粒越多，低角度散射光包含的颗粒度信息越多，而我们的分类标准是在低角度反映体积信息这一理想条件下的，因此这种散射信号的相关性显然对细胞的分类显然是不利的。

当两路信号的相关性越强时，他们的二维散点图会沿着朝向原点的方向倾斜，倾斜是散射信号存在相关性的一个显著特征。

图5给出了两路完全相关信号在二维散点图上的表现。

图 5 完全相关信号的散点图
3 解决方案
针对以上的分析，要减小两个角度散射信号的相关性，可以采用的方法有：
1.通过改变散射信号的收集角度减少两个信号的相关性：减小小角度散射光的收集角
度下限和上限，增加高角度的收集角度下限。

小角度收集角度的下限减小了，会有
更多的反映体积信息的光散射信号被收集，同时，减少小角度散射信号的收集角度
上限，则小角度散射信号中包含的细胞颗粒度信息也减少了。

2.通过理论分析找到两个角度散射信号之间的关系，在低角度散射信号中除掉高角度
散射强度分量。

方案1中，减小小角度收集角度的下限，会对小角度限制光阑的制造精度提更高的要求，因为角度越小，光阑的加工误差越大，会带来系统的不一致性。

图 6 减小低角收集光阑的范围
方案2试图找到一种方法，在硬件系统不改动的情况下，用数据处理的方法，将两种散射信号的关系找出来然后减小他们之间的相关性。

根据2.2节的分析，细胞内部的颗粒越多，高角的散射信号越强，对低角散射信号的贡献也越大，因此可以在低角信号中减掉部分反映颗粒信息的高角信号，而减掉高角信号的量与收集角度和电路都有一定的关系。

4 实验及数据
根据以上的分析，在五分类血液细胞分析仪上对白细胞的分类进行了研究，数据如下：2005-11-25data 试剂2#机下午 08-26-20ConsoleData.dat
2005-11-30 下午 04-37-24ConsoleData.dat
2005-12-6Data 试剂2-1#光学 04-56-18ConsoleData.dat
2005-10-17data上午 10-33-17ConsoleData.dat
2005-11-3data 2#整机下午 02-33-15ConsoleData.dat
2005-11-03data 下午 04-58-41ConsoleData.dat
5 结论
通过对白细胞两类信号的相关性分析，针对散射信号存在相关性的显著特征-散点图倾斜，采用数据处理的办法减小了散射信号相关性的对细胞分类的准确度地影响，提高了分类能力，实践证明这是一种有效的方法。