免疫荧光检查
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光结果解读
免疫荧光是一种常用的检测方法，用于检测和定位蛋白质、抗体和其他生物分子。
在免疫荧光结果解读中，需要了解以下几个方面：
1. 阳性和阴性结果：免疫荧光结果通常分为阳性和阴性两种。
阳性表示样本中存在目标分子，而阴性则表示不存在。
2. 荧光强度：荧光强度是指样本中荧光信号的强度。
荧光强度高表示目标分子数量多，荧光强度低则表示目标分子数量少。
3. 染色模式：染色模式是指样本中荧光信号的分布方式。
常见的染色模式有均匀染色、斑点状染色、线状染色等。
4. 背景噪声：背景噪声是指非特异性结合或其他因素引起的荧光信号。
高背景噪声会影响结果的准确性。
5. 比较分析：免疫荧光结果需要与正常对照组进行比较分析，以确定是否存在异常情况。
T细胞亚群的检测 —免疫荧光法
T细胞亚群的检测—免疫荧光法【申请单】请完成申请单所要求项目×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】表1-1 T细胞亚群的检测方法方法流式细胞术免疫荧光法AP-AAP桥联酶免疫法√本次检查选择【材料准备】1.抗CD McaB、兔抗鼠IgG荧光抗体。
2.受检者肝素（或EDTA）抗凝静脉血。
3.含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液。
4.细胞分离液。
5.细胞计数板。
6.离心机、落射荧光显微镜。
【操作方法】1.取肝素抗凝血1.5ml，与等量生理盐水混匀，轻轻叠加在3ml细胞分离液上，转速2000r/min离心，离心时间20min。
吸取单个核细胞层（PBMC），用RPMI1640培养液洗涤，1000r/min离心2次，每次10min.弃上清，加入RPMI1640培养液，配成5×106/ml细胞悬液。
2.按厂家说明稀释抗CD McaB至工作浓度，取0.1ml，加等量步骤1制好的细胞悬液，混匀后，4℃下静置45min。
离心弃上清，再用洗2次，弃上清；3.配制合适浓度兔抗鼠IgG荧光抗体，取0.1ml加入步骤2制好的沉淀细胞中混匀，4℃下静置30min，用RPMI 1640培养液洗涤，800r/min离心3min，共洗3次。
吸弃大部分上清液，混匀沉淀细胞，滴于细胞计数板后荧光显微镜下观察。
【观察结果】在落射荧光显微镜下进行观察，计数200细胞，以荧光强度≥2为阳性，计算阳性细胞百分比率。
【注意事项】1.严格按厂家说明书配置工作浓度试剂。
2.注意控制实验环境温度。
3.按顺序加入试剂，按操作规程进行操作，避免造成误差。
4.检测完毕后应仔细核对、记录、避免笔误。
5.不同的检测方法结果参考值有区别，参考区间为：CD3+细胞：（71.5±6.2）％或65-80％，CD3+CD4+细胞：45.7±5.3％，CD3+CD8+细胞：27.9±5.0％，CD4+/CD8+:1.66±0.33。
免疫荧光检查
（3）自身抗体测定：采用间接法，对结缔组织病，尤其是系统性红斑狼疮的诊断有 很大意义，对大疱性皮肤病也有较大意义。以抗核抗体为例，实验室的观察内容介 绍如下：①定性。先以低倍镜观察，再转高倍镜证实，见到亮绿色荧光且与底核形 态一致者为阳性。②定量定滴度。将阳性标本做一系列倍比稀释，见到明确阳性荧 光的最后一个稀释度为该病人血清的滴度。③定形态。用高倍镜甚至油镜观察，常 见的荧光样式有：均质状——核染均匀一致，反映抗去氧核糖核蛋白或DNA（去氧 核糖核酸）抗体，可见于各种结缔组织病。周边状——胞核周围有较中央明显的荧 光带，反映抗DNA 抗体，主要见于SLE（系统性红斑狼疮）。斑点状——核体内有 许多小的荧光点，均匀分布，反映可溶性核蛋白抗体，主要见于硬皮于SLE。 除了抗核抗体外，用间接免疫荧光法还可检测dsDNA（双链去氧核酸）抗体等。
免疫荧光检查
第 1页
1.方法
根据抗原-抗体反应的不同，免疫荧光检查有以下3种。
第 2页
（1）直接法：用以检查病人皮肤组织中有无免疫球蛋白或补体 的沉积。用特异荧光抗体直接滴加于待检标本上，由荧光素标 记的抗体与抗原发生特异结合，使之呈现荧光，根据荧光分布 和形态确定抗原部位和性质。此法简单、特异，能用已知抗体 检查未知抗原，但一种标记抗体只能查一种抗原。直接法采用 病人的病变组织，冷冻切片（4μm 厚）后，做荧光染色。
（2）病理组织学方面：均采用直接法。①基底膜荧光：红斑狼 疮显示颗粒状或块状崎岖不平的荧光染色，以IgG 及补体C3为 主。疱疹样皮炎于真皮乳头体内有颗粒状Ig A 沉积。类天疱疮 、妊娠疱疹及获得性大疱性表皮松解症，显示线状IgG 及补体 C3沉积。线状Ig A 大疱病有基底膜带线状Ig A 沉积。②细胞 间荧光于天疱疮可见表皮细胞间IgG 沉积。③血管壁荧光于多 种脉管炎可显示管壁或管周荧光染色。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光技术
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀 后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述 PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀 后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液， 进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 中间洗脱出来的是荧光标记合适的抗体部分。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 但经此法纯化，标记抗体损失达50%。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织 的组织粉预先吸收。 按每ml标记抗体加100mg组织粉比例混合， 4℃ 磁力搅拌1h，静置1h，1800r/min于4℃条件下离 心20min取上清液，再用每ml标记抗体加组织粉 比例重复一次。
（三）荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
P:总蛋白质的量。F：荧光色素量。（物质的量）
*
*
固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜.
F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
F/P=
IgG (mg/ml)
荧光色素（μg/L ） 160 000x10 3 荧光色素 ( μg/L ） x 0.4 x 6
IgG (mg/ml) 390x10
病毒
无水乙醇,丙酮、CCl4
（3）固定后处理
抗原固定后必须立即以冷PH7.4 PBS冲洗,顺序经过三缸 浸泡,每缸3min，末次再以蒸馏水浸泡1min以脱盐。 标本固定干燥后最好立即进行荧光染色及镜检，如必须 保存则应保持干燥，置于4℃以下保存，一般细菌涂片或 组织切片经过固定后可保存一个月以上，但病毒和某些 组织 抗原标本则需-20℃以下保存。
免疫荧光检查
玻片
抗原抗体复合物
标记抗体
双抗体复合物
优点：
（1）既能检查未知抗原，也能检查未知抗体。 （3）敏感性高。
（ 2 ）用一种标记抗体，能检查多种抗体复合物。
缺点：
（ 1 ）由于参加的因素多，受干扰的机会也多， 故结果有时判断困难。 （2）方法较麻烦，时间较长。
3、补体荧光抗体法：用荧光素标记的抗补 体抗体检测未知抗原或未知抗体。
免疫荧光技术在 某些皮肤病中 的 应用
主讲人：周桂芝
概 述
抗原与相应的抗体接触后，立即结 合而形成不易分离的抗原抗体复合物。 在结合之前，先使抗体（或抗原）与某 些显色剂偶联，则形成的抗原抗体复合 物由不可见成为可见，从而可以确定组 织中是否存在某种抗原（或抗体），这 就是免疫病理技术的基本原理。根据抗 体（或抗原）标记物的不同分为免疫荧 光技术和免疫酶标技术。
2、天疱疮：
DIF 患者几乎百分之百均可查到表 皮细胞间抗体，呈鱼网状沉积，主要为 IgG，约30—50%病人可有IgM、IgA。 未治疗的病人伴C3。红斑型天疱疮除了 在表皮出现细胞间IgG抗体外，23-80% 的病人伴有基底膜抗体沉积。
IIF 查病人血清，约80—90%天疱
疮病人有循环的抗表皮细胞间抗体，主要 是IgG。病人血清中抗细胞间抗体的滴度 与病情的活动性有密切关系。抗体滴度 1:20—1:40为低滴度，1:80—1:160为中等 滴度，1:320以上为高滴度。应每2-3周做 一次IIF，直至病情减轻，以后每3—6个 月复查一次。
图16
图17
图18
图19
图20
图21
图22
参考文献
1、Inter J Dermatol 1993;32(3):153-161
间接免疫荧光法测ANA课件
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟。
实验步骤八: 冲洗
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液, 流水冲洗载片, 然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小 杯中浸洗至少5分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl) 伊文氏蓝进行复染。
然后再进行下一个载片的操作。
实验步骤十: 结果判断
➢荧光显微镜下观察荧光。
结果判读:
荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞, 不发
荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性, 否
则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
【均质型】 细胞核呈均匀一致的荧光
【核仁型】 核仁部分呈现荧光
某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富
ANA检测的意义
有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；
观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理
【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
✓滴度定义: 与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察 到特异性荧光反应的最高稀释度
【临床意义】
总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一 个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫 性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测 各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病 情观察、预后及治疗评价有重要意义。
未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－ 100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混 合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁 性肝硬化等。
抗核抗体检测方法
抗核抗体检测方法抗核抗体检测是一种检测人体免疫系统中是否产生抗核抗体的检测方法。
抗核抗体是人体免疫系统对自身细胞核成分产生的自身抗体，它的产生可能与某些自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、结缔组织病等。
抗核抗体检测是诊断这些疾病的重要方法之一。
目前，常见的抗核抗体检测方法主要有免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附法（ELISA），其中IFA是目前广泛应用的技术。
以下是这两种检测方法的详细介绍：免疫荧光法（IFA）：免疫荧光法是通过抗体与标记有荧光物质的抗人免疫球蛋白结合，实现对抗体的检测。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备标本。
可以使用血清、脑脊液、淋巴细胞等标本，其中血清是最为常用的标本类型。
血清标本采血后离心分离血清即可。
步骤二：制备抗原。
可以用抗人免疫球蛋白（免疫球蛋白基因可以人工合成并表达），或者天然来源的细胞核抗原作为实验抗原。
抗原可以通过固相免疫部署在载玻片上，称为荧光抗核。
步骤三：加荧光抗体。
将标本加入荧光抗核预处理的载玻片上，通过抗体和荧光物质的结合，发出特定波长的荧光。
观察荧光显微镜下标本是否有抗核抗体与荧光抗核结合，并发出荧光信号。
酶联免疫吸附法（ELISA）：酶联免疫吸附法是采用抗原-抗体的特异性结合反应，利用酶标记反应物在固定载体上清晰可见的特性，将免疫反应产生信号转化成可见光信号。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备抗原。
与免疫荧光法相同，抗原可以用抗人免疫球蛋白或天然来源的细胞核抗原，固相免疫后称之为ELISA 片。
步骤二：制备酶标记抗体。
将具有高特异性的单克隆或多克隆抗体标记酶，如HRP、AP等，完成酶标记抗体的制备。
步骤三：获取样本。
样本的获取方法与免疫荧光法相同。
步骤四：洗涤。
将标本加入固定好的载体上，在空鼓内进行反应，然后通过流速控制洗涤液将未结合抗体和载体间的干扰物和废弃物全面清除。
步骤五：加入酶标记抗体。
将上述洗涤过的载体加入酶标记抗体，形成“反应物-酶标记抗体-待测样本抗体”复合物。
免疫荧光方法
免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。
利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。
免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。
这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。
最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。
基本实验步骤:(1) 细胞准备。
临床免疫学检验-荧光免疫技术
标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品)
标记抗体的纯化：透析法、凝胶过滤法
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：凝胶过滤法
2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义
争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光 标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。 由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离 的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所 产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中 测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反 比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关 系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。
BG：325-500
OG：410-650
(exciting the fluorochrome) ↓
each droplet (cell) emits the fluorescence
(small electrical change)
10. Flow cytometry & Fluorescence
• Fluorochromes have the ability to absorb energy from light an emit it at a longer wavelength.
• 某些物质能够从外部接受能量而进入激 发态,当其从激发态回复至基态时,过剩 的能量以电磁波的形式发射称为发光(荧 光).
ห้องสมุดไป่ตู้
• 时间分辨 • Stokes位移（激发光谱和发射光谱的波长
差）
• 较窄的发射光谱（613nm +- 10nm)
免疫荧光技术
一般常用DAPI复染。
7、封片： 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液； 避免产生气泡。
5、二抗孵育条件：
二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；
而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度； 切记要避光反应；
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间；
四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉 末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与 FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用 于单独标记染色。
【固定液的选择】
2、冰冻切片制备：
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
3、血清封闭： 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致） 封闭，减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低 背景。 血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的
定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间
活细胞动态观察。
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。
干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。
-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
病理免疫荧光检查流程
病理免疫荧光检查流程病理免疫荧光检查是一种常用的病理学手段，用于检测组织标本中的抗原和抗体，以帮助医生进行诊断和疾病分类。
该检查流程具有高度的特异性和敏感性，能够辅助医生准确诊断多种疾病。
下面将详细介绍病理免疫荧光检查的流程。
一、标本采集和处理病理免疫荧光检查需要提供组织标本，一般是通过活检或手术切除获取。
标本采集后，应立即放入含有理想固定剂的容器中，如10%中性缓冲福尔马林。
固定剂的选择应根据检测目的和标本性质来确定。
固定后，标本需要进行脱水、透明化和包埋等处理，以便于切片和染色。
二、切片和染色切片是将固定的组织标本切成薄片，以便于观察细胞和组织的结构。
切片过程中，需要使用特殊的切片机器和切片刀，确保切得薄而均匀。
切片完成后，需要对切片进行染色处理，以增强细胞和组织的对比度。
常用的染色方法有血液常规染色和特殊染色等。
三、抗原恢复抗原恢复是为了提高抗原的检测效果，常用的方法有热处理和酶解等。
热处理是将切片放入高温蒸汽中进行处理，以使抗原更易于检测。
酶解则是使用特定的酶对切片进行处理，以使抗原暴露在切片表面。
四、抗体标记抗体标记是病理免疫荧光检查的核心步骤。
在该步骤中，需要选择特异性的抗体，并将其与荧光物质或酶物质结合。
这样，在抗体与抗原结合后，通过荧光显微镜或酶标仪等设备，可以观察到特定颜色的荧光或酶反应产物，从而确定抗原的存在与否。
五、显微镜观察和结果分析将标本切片放置在显微镜下进行观察，通过荧光显微镜或透射电子显微镜等设备，可以观察到组织和细胞的荧光信号或酶反应产物。
根据荧光信号的位置、形状和强度等特征，可以判断抗原的分布和表达情况。
医生需要仔细观察和分析切片，并结合临床资料进行综合判断和诊断。
六、结果报告和诊断根据显微镜观察的结果，结合临床病史和其他辅助检查结果，医生可以给出最终的诊断。
诊断结果一般以书面形式进行报告，并向临床医生或患者提供。
报告中应包括病理诊断、检测方法和结果等信息，以便于医生进行治疗和决策。
免疫荧光实验技术
595～600nm（橙 FITC的衬比染色或双
红色）
标记FAT
四甲基异硫氰酸罗 丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 340nm
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT
575nm（红色） 双标记FAT、流式细 胞术
613nm
时间分辨荧光免疫测 定
免疫荧光技术实验 封闭，抗体孵育
封闭：目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常 用的封闭剂为 BSA, （PBS pH 7.5）,其他可选择的封 闭剂还有 1% 凝胶 gelatin, 1% bovine 或与二抗种 属相同的血清（3-10%）等。室温和4℃均可以。
抗体孵育：直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧 光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育 的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防 止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
免疫荧光技术简介:荧光
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强 度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录 的相应的荧光发射强度。
荧光寿命：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退 称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
荧光显微镜
Chance Favors Only the Prepared Mind.
免疫荧光技术简介:抗体
抗体（Antibody）：抗体指机体的免疫系统在抗原刺 激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分 泌液中。
皮肤直接免疫荧光检查
皮肤直接免疫荧光检查
皮肤直接免疫荧光检查（Direct Immunofluorescence，DIF）是一种高敏感度的诊断方法，可以快速准确地检测人体表皮或者真皮组织中抗原抗体的结合情况。
它是利用荧光免疫学原理，将抗体标记上特殊的染色剂，使之能够发出某种特殊颜色的发光，从而对疾病的存在与否进行检测的一种方式。
皮肤直接免疫荧光检查（DIF）主要应用于诊断自身免疫性疾病，如牛皮癣、带状疱疹、类风湿性关节炎、系统性硬化症等等。
DIF也可以用于诊断肿瘤，如淋巴瘤和胃肠道肿瘤等。
皮肤直接免疫荧光检查是通过在特定的组织中，使用特殊的染色剂来检测抗原抗体结合情况的。
具体步骤如下：
1、准备样本：首先，将要检测的皮肤脱落部位取下，并将其放置在一个明确的清晰的晶片上，便于下一步的操作。
2、加入染料：然后，将检测所需的抗原抗体或抗体溶液加入到皮肤样本上，使其与抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
3、加入染色剂：接下来，将染色剂加入到皮肤样本上，使抗原-抗体复合物能够发出特殊颜色的发光。
4、照射紫外线：最后，将抗原-抗体复合物照射上紫外线，使其发出不同颜色的发光，从而检测疾病的存在与否。
如果结果显示，抗原-抗体复合物发出的发光呈现特定颜色，则表明存在某种特定疾病。
相反，如果抗原-抗体复合物未发出发光，则表明不存在该疾病。
皮肤直接免疫荧光检查是一种非常有效的诊断方法，它可以在短时间内准确地检测出患者患有哪些自身免疫性疾病或肿瘤。
此外，DIF也可以用来监测疾病的发展情况，从而帮助医生更好地控制病情。
间接免疫荧光法检测ANA标准操作程序
间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF )检测ANA标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠，为临床诊断提供可靠的参考依据【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【方法】间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF)。
【标本的采取和保存】随机静脉血3ml，分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
【原理】稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在Hep -2细胞(人喉癌上皮细胞)抗原基质上，如果被检清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性地和抗原基质片上Hep-2细胞中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物(主要是IgG类)，再与兔或羊抗人免疫球蛋白IgG荧光标记抗体结合，在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞细胞核和/或细胞浆抗原位置发出特异的亮绿色荧光，为抗核抗体(antinuxlear antibodies, ANA )阳性。
【仪器】荧光显微镜【试剂】ANA IIF试剂盒，德国欧蒙公司产品，每个反应区有两种抗原复合基质：猴肝组织和人Hep-2细胞。
【操作程序】1.准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记：(为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抗原+抗体+补体复合物
抗补体标记抗体
荧光标记补体复合物
优点：
具有间接法的一些优点。
缺点：
非特异性荧光更多。
在皮肤病中的应用
免疫荧光检查，对某些皮 肤病已成为一种极重要的临床 和组织学检查的补充方法，既 能检查血清，又能检查活体标 本。
（一）标本
1、血清标本：取血2ml，不加 抗凝剂，室温下放置片刻，凝 固 离心 分离出血清 冷 冻保存。 2 、皮肤活检标本：进行皮肤 活检时，其所取标本部位的选 择十分重要，直接关系到免疫 病理的结果如何。
近来，皮肤病理工作者应 用免疫荧光技术对大疱性皮肤 病、红斑狼疮、扁平苔癣、银 屑病、皮肤血管炎等免疫病理 特征进行了研究，并已广泛应 用于常规病理诊断、鉴别诊断 及指导治疗。
缺点：
（1）标记的荧光极易褪色，不能长久保 存。 （2）影响荧光强度的因素很多，而且判 断阳性荧光与非特异性荧光有一定的主 观性。 （3）阳性荧光细胞无法与常规石腊切片 对照观察，组织学定位困难。 （4）需要较好的冰冻切片机和荧光显微 镜等，因此它的应用受到一定的限制。
抗原
标记抗体
玻片
标记抗原抗体复合物
优点：
（1）方法简单，需时短。 （2）特异性强。
缺点：
（1）不能用已知抗原检查未知抗体。 （ 2 ）为了检查各种抗原，需要准备多种 特异性荧光抗体。 （3）敏感性较差。
2、间接法（ IIF） ：用荧光标记的抗体来
检查未知抗原或未知抗体。
抗原 抗原抗体 复合物
未标记抗体
疾病
活检部位
沉积部位
红斑狼 皮损和正常 表皮、真皮连接处颗粒状IgG、 疮 皮肤（SLE） IgM、IgA
SCLE
表皮颗粒状IgG 基底膜线状IgG、IgA（50%病 大疱性 损害周围皮 历），表皮、真皮连接处颗粒状 红斑狼 肤 IgG、IgM、IgA、C3（50%病 疮 历） 皮肌炎 皮损
硬皮病 皮损 表皮、真皮连接处灶性IgG、 IgM、胶样小体；皮肤和肌肉血 管周围IgM 通常为阴性，表皮细胞核IgG， 偶然
损害周围皮肤
基底膜线状C3、IgG
疾 病
活检部位
沉积部位
线状IgA大 损害周围皮 基底膜线状IgA、IgG 疱性皮肤病 肤 损害附近正 疱疹样皮炎 真皮乳头IgA、C3 常表现皮肤 损害周围皮 基底膜线状C3、偶 妊娠疱疹 IgG 肤 大疱周围皮 基底膜线状IgG、C3 扁平苔癣类 肤和扁平苔 IgG、IgM、IgA、C3 天疱疮 藓样损害 胶样小体
玻片
抗原抗体复合物
标记抗体
双抗体复合物
优点：
（1）既能检查未知抗原，也能检查未知抗体。 （3）敏感性高。
（ 2 ）用一种标记抗体，能检查多种抗体复合物。
缺点：
（ 1 ）由于参加的因素多，受干扰的机会也多， 故结果有时判断困难。 （2）方法较麻烦，时间较长。
3、补体荧光抗体法：用荧光素标记的抗补 体抗体检测未知抗原或未知抗体。
皮肤病免疫荧光
疾 病
天疱疮
活检部位
沉积部位
表皮细胞间IgG、基 底膜线状C3、IgG 表皮细胞间IgA
皮损周围正常皮肤 表皮细胞间IgG、C3
副肿瘤天 皮损周围皮肤 疱疮 IgA天疱疮 损害周围皮肤
大疱性类 红斑损害周围皮肤 基底膜线状C3、IgG 天疱疮
瘢痕性类 损害周围皮肤 天疱疮 EBA 基底膜线状C3、IgG
皮损
（二）皮肤病
1、红斑狼疮：在目前红斑狼疮的诊
断和研究中，直接免疫荧光（ DIF ）已成 为一种重要的手段。 （1）狼疮带试验（LBT）：用直接免 疫荧光法来确定DLE皮损，SLE皮损及正 常皮肤的表皮、真皮交界处免疫球蛋白和 补体的沉积。一般沉积抗体是以IgM、 、C3为主，IgA少，呈线状或带状或 颗粒状。有时真皮内血管壁上可有IgG、 IgM沉积。
免疫荧光技术的发展
·1941年 由Coons首先建立了免疫荧光技术 ·1961年 由Kaskin首先将该技术应用到皮肤科 ·1963年 Burnham等报告了红斑狼疮病人表皮、 真皮间基底膜IgG、C3沉积 ·1964年 Beutner和Jordon利用免疫荧光技术研 究天疱疮 ·1967年 区分出大疱性类天疱疮 ·70年代开始应用免疫电镜去认识大疱性皮肤病
（2）LBT诊断价值：
①LBT 是诊断 LE 的重要检测方法， 具很高的特异性， SLE 皮损部位 LBT 阳 性率为 90% ，未受累皮肤为 54% ， DLE 皮损处为90%。如果LBT（+）可以确诊 LE，因此能将临床上与LE相似的其他皮 肤病鉴别。但是LBT（-）也不能排除LE， 因LE患者的LBT不是百分之百的阳性。
免疫荧光技术在 某些皮肤病中 的 应用
主讲人：周桂芝
概 述
抗原与相应的抗体接触后，立即结 合而形成不易分离的抗原抗体复合物。 在结合之前，先使抗体（或抗原）与某 些显色剂偶联，则形成的抗原抗体复合 物由不可见成为可见，从而可以确定组 织中是否存在某种抗原（或抗体），这 就是免疫病理技术的基本原理。根据抗 体（或抗原）标记物的不同分为免疫荧 光技术和免疫酶标技术。
免疫荧光技术
（一）原理： 将荧光色素（异硫氰酸荧光素） 与特异性抗体以化学的方法结合起 来，即为荧光抗体，再用这种荧光 抗体作为一种试剂，在特定的条件 下浸染标本，与标本中相应的抗原 结合。在组织中形成含有荧光标记 的抗体 — 抗原复合物，再用荧光显 微镜观察标本。
（二）方法：
1、直接法（DIF）：用荧光素标记的特 异性抗体来检查未知抗原。如组织中存有相 应的抗原，便结合，形成复合物。
2、天疱疮：
DIF 患者几乎百分之百均可查到表 皮细胞间抗体，呈鱼网状沉积，主要为 IgG，约30—50%病人可有IgM、IgA。 未治疗的病人伴C3。红斑型天疱疮除了 在表皮出现细胞间IgG抗体外，23-80% 的病人伴有基底膜抗体沉积。
②LBT可用于SLE与DLE的鉴别诊断。 ③对无皮损的SLE，LBT有助于诊断。
④LBT对SLE与其他抗核抗体阳性疾病
作鉴别时，具有参考价值。
⑤狼疮带假阳性。
狼疮带对治疗敏感，经大约6个 月 治 疗 后 ， LBT 可 转 变 为 阴 性 ， （血内抗体阴转可很快，但皮损内 抗体消失慢），SLE病情加重LBT由 阴性转为阳性。（Ig沉积在基底细胞 的半桥粒、基底板内及真皮内的纤 维成份中）